捕食线虫真菌捕食器相关基因标记Ⅱ．捕食器基因不表达转化子的形态特征及核酸杂交分析.pdfVIP

维普资讯 菌 物 学 报 23(4)：487-493，2004 Mycosystema 捕食线虫真菌捕食器相关基因标记II． 捕食器基因不表达转化子的形态特征及核酸杂交分析 莫明和 黄 英 徐 进 张克勤 (云南大学生物资源保护与利用重点实验室 昆明650091) 摘 要：本文从利用质粒pBChygro转化少孢节丛孢YMF1．00544的2135个转化子中筛选到一株捕 食器基因不表达的转化子YMF1．00110。该转化子的形态学特征与野生型菌株有明显区别，对该转 化子的核酸杂交结果表明质粒DNA是以单拷贝的方式整合到真菌染色体上。此外，对部分转化 子的杂交整合模式和标记率进行了杂交分析。 关键词：少孢节丛孢，形态突变，DNA整合模式 中图分类号：Q939．97 文献标识码：A 文章编号：1672—6472(2004)40—4087—4093 利用限制性内切酶介导的DNA整合技术(restrictionenzyme—mediatedDNAintegration，REMI) 既可以对真菌进行标记，又可以产生特定的突变子。目前对捕食线虫真菌捕食器相关基因的研究 未见文献报道。换而言之，目前对捕食器的基因背景一无所知，在这样的情况下要克隆捕食器相 关基因，通过 REMI转化捕食线虫真菌获得捕食器基因不表达的转化子，再通过质粒拯救技术 (plasmidrescue)分析外源DNA插入片段附近的染色体DNA，可以实现克隆捕食器相关基因的 目的。在前期工作中 (莫明和等，2004)已经报道了利用REMI技术转化捕食线虫真菌，获得了 一 批转化子，并对转化子的各种特征进行了分析。本文继续报道在该实验中获得的捕食器基因不 表达转化子的相关研究结果。 1材料与方法 1．1捕食器基因不表达转化子的筛选 将少孢节丛孢ArthrobotrysoligosporaYMF1．oo544~ 菌株及利用质粒pBChygro转化该菌 株获得的转化子接种到CMA (玉米粉20g，琼脂 1gg，水100mL)平板上，28~C培养7～14天后， 在平板中央切除l×2cm 的琼脂块，继续培养3~4天，待菌丝长满整个切除区域后加约500条线 虫Panagrellusredivivus诱导捕食器的形成。当野生型产生捕食器时开始检测转化子是否产生捕食 器。将不产生捕食器的转化子挑选出来，再重复两次以上捕食器的诱导实验，如果在三次诱导实 验中均未产生捕食器的转化子就被确定为捕食器基因不表达的转化子。 1．2捕食器基因不表达转化子的形态学观察 将野生型菌株及其捕食器基因不表达转化子接种到 、)l，A培养基 (琼脂 18g，蒸馏水定容至 lO00mL)和s培养基 (胰蛋白胨 10g，葡萄糖 lOg，琼脂18g，蒸馏水定容至 lO00mL)，28~C培 国家自然科学基金 ，云南省科技厅人才培引基金 (2003RC03)资助项目；科技部973计划项目(2003CB415100) 科技部攻关项目(2002BA901A21) 通‘讯作者 E-mail：kqzhang1@yahoo．tomca 收原稿日期：2004-04．02，收修改稿日期：2004．06—23 维普资讯 488 菌 物 学 报 23卷 养7～14天后，观察菌落形态及显微特征。 1-3转化子的Southernblot分析 1．3．1转化子基因组 DNA 的提取 (CTAB法)：将真菌接种于 150mL液体 S培养基中，28℃ 150rm／in培养5d，真空抽滤收集菌丝体，将菌丝体装入10×18的采集袋中，用手轻压成均匀的 薄层，用液氮冷冻后迅速倒入无菌的冷研钵中研磨成粉状，并分装到1．5mL离心管中(约0．3g)； 加入5001．tLCTAB提取液，混匀后60℃水浴90min；加入等体积的酚：氯仿(1：1)，混匀后13000rm／in 离心30min；取上清液，加等体积的酚：氯仿 (1：1)，混匀后13000rm／in离心30min，重复抽提2～3 次，直到界面无沉淀；