捻转血矛线虫（H．contortus）ZJ株H11蛋白基因的克隆及序列分析.pdfVIP

维普资讯 畜牧兽医学报 ，2005，36(4)，387—390 AetaVeterinaria etZootechnicaSinica 捻转血矛线虫 (H．contortus)ZJ株 Hll 蛋白基因的克隆及序列分析 杜爱芳，李孝军，侯玉慧，王素华 (浙江大学动物预防医学研究所。杭州 310029) 摘 要：参照已发表的捻转血矛线虫 H11蛋白基因序列设计引物，以H．Co~ltortusZJ株的总RNA为模板 ，进行 RT—PCR扩增，成功扩增出H11基因。将 PCR产物与 pUCm—T载体连接后，转化 DH5c~感受态细胞 ，筛选阳性克 隆并测序。序列分析表明，其核苷酸序列与国外报道的H11基因的同源性为99．5 。编码氨基酸序列具有氨基 肽酶的保守序列 。推测可使虫体不能获得所必需的氨基酸而导致死亡。 关键词 ：捻转血矛线虫 ；H11；基因克隆；序列分析 中图分类号：$852．73 1；Q78 文献标识码 ：A 文章编号：0366-6964(2005)04—0387-04 捻转血矛线虫是牛羊等反刍动物的主要寄生虫 1 材料和方法 之一，分布很广，对反刍动物危害很严重，尤其在牧 1．1 主要材料和试剂 区，每年早春期问，牲畜营养不 良时，常造成大批死 1．1．1 虫体 捻转血矛线虫 zJ株成虫，由浙江大 亡。据调查|1]，浙江、湖北等地该病 的感染率达 学动物预防医学研究所寄生虫实验室保存。 6．49 ～96 ；在一些牧区的羊群中流行尤为严重， 1．1．2 工具酶 SuperTaqDNA酶为申能博彩公 山羊、绵羊的感染率达 7O ～8O ]。国外据Nin— 司产品，限制性 内切酶 Sal工、HindⅢ和TDNA连 giga等报道 ，绵羊感染捻转血矛线虫死亡率达到 接酶为 TaKaIa(大连)有限公司产品。 4O ；Jacquiet等报道|4]，西非在雨季有8O ～85 1．1．3 试剂盒 DNA片段玻璃奶纯化回收试剂 的羊感染捻转血矛线虫。该病 目前普遍采用抗虫药 盒、高效感受态 DH5a试剂盒等均为北京博大泰克 进行防治，由于药物的残留及虫株耐药性的产生，迫 生物基因技术公司产品，cDNA合成试剂盒为申能 切需要补充或替代的方法如预防接种以控制其感染 博彩公司产品。 和流行。 1．1．4 载体 pUCm—T为申能博彩公司产品。 H11是捻转血矛线虫四期幼虫和成虫肠腔面 1．1．5 其他试剂 Trizol试剂为上海生工产品， 分离的微绒毛完整膜蛋白，剂量一效应试验显示：注 DEPC、苯酚为申能博彩公司产品，其余试剂均为国 入 1O～1O0 g的 H11，以虫负荷作指标，动物剖检 产分析纯。 发现 95 得到保护 ，以产卵率为指标，则 99 得到 1．2 方法 保护|5]。因而 H1l是抗血矛线虫疫苗中一种非 1．2．1 捻转血矛线虫成虫总RNA的提取 参照 常有效的组分。但 由于寄生虫体外培养困难，并且 文献[8]从组织中制备RNA进行总 RNA抽提，后 H11蛋白的分离也相当费时、费力 ，从而制约寄生 经甲醛凝胶电泳确定无降解后，一80。C保存。 虫疫苗发展。用分子生物学的方法可解决这一 问 1．2．2 H11抗原基因的RT—PCR 题 。国外已对 Hl1蛋 白基因进行了克隆和表达；国 1．2．2．1 引物设计： 按照 Smith等发表的序 内尚未见相关方面的报道 。本研究采用 DNA重组 列 ]，根据其阅读框的序列特点，两端分别加上 Sal 技术，对其 H11抗原基因进行 了克隆和序列分析， I和 HindIll酶切位点及保护碱基设计引物： 为进一步开展 H11基因的表达奠定基础。