猪源支气管败血波氏杆菌百日咳杆菌黏附素基因的原核表达及其抗体检测ELISA方法.pdfVIP

维普资讯 微生物学报ActaMicrobiologicaSinica 48(3)：330-336；4March2008 ISSN0001—6209；CN11-1995／Q http：fnoumfls．im．ac．cn 猪源支气管败血波氏杆菌百 日咳杆菌黏附素基因的 原核表达及其抗体检测ELISA方法 赵战勤，薛云，吴斌，汤细彪，陈焕春，李增强，胡睿铭，张建民，段龙J (华中农业大学动物医学院，农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070) 摘要： 【目的】以猪源支气管败血波氏杆菌(Bordetellabronchiseptica，Bb)百 日咳杆菌黏附素(PRN) 基因的原核表达产物为抗原建立检测PRN抗体的间接ELISA方法。【方法和结果 】利用谷胱甘肽．s． 转移酶(GST)表达系统对PRN基因在大肠杆菌中进行融合表达。SDS．PAGE和Westernblot检测证 实该基因获得高效表达，产物易于纯化且具有 良好的免疫学活性。通过凝血酶酶切 GST-PRN并回收， 获得不含 GST载体蛋白的PRN蛋 白片段。以PRN蛋白片段为抗原建立检测天然 PRN抗体的间接 ELISA方法。该方法对猪巴氏杆菌病等 7种常见细菌性疾病阳性血清的检测结果均为阴性，其敏感 性 比乳胶凝集试验提高 4～128倍，能检测到人工感染 14d后的仔猪血清抗体 IgG 对临床送检的 l，229份猪血清的检测阳性率为 32．7％。ELISA方法对阳性猪场的监测结果预示了保育期仔猪的合群 导致猪群大量感染支气管败血波氏杆菌。【结论 】该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点， 可用于猪群 PRN抗体水平监测和猪波氏菌病流行病学调查。 关键词：支气管败血波氏杆菌；百 日咳杆菌黏附素；ELISA 中图分类号：R392 文献标识码：A 文章编号：0001．6209(2008)03．0330．07 支气管败血波氏杆菌(Bordetellabronchiseptica， 目前，针对猪波氏菌病诊断方法的报道很少，主要 Bb)可引起猪发生肺炎和非进行性萎缩性鼻炎，也是 是细菌学检查、血清学凝集试验、PCR检测等方法…。 猪呼吸道疾病综合症的重要致病因子之一…。更重要 细菌学检查是通过从肺冲洗物、尸检肺组织及鼻分泌 的是，Bb的先期感染易于导致其它多种细菌性和病毒 物中进行病原菌的分离、鉴定，该方法的缺点是操作 性病原，如多杀性 巴氏杆菌(Pasteurellamulticida， 技术要求较高、过程繁琐 、花费时间长。而血清学凝 Pm)、猪链球菌(Streptococcussuis， suis)、副猪嗜血 集试验和 PCR检测方法常出现假阳性结果。这是因 杆菌(Haemophilussuis， )、猪繁殖与呼吸综合征 为，血清学凝集试验以灭活 Bb菌体为检测抗原，该 病毒 (PorcinereproductiveandrespiratorySyndrome 抗原易于和巴氏杆菌、链球菌等的血清抗体发生交叉 virus，PRRSV)、猪流感病毒 (Swineinfluenzavirus， 反应 【引；PCR方法虽然能够检测到Bb的存在，但作 SIV)等的继发感染，从而提高猪群呼吸道疾病的发病 为一种呼吸道常在菌， 的存在并不一定代表猪群已 率和严重程度，造成较大损失fl】。近年来，人们发现 经发生感染或者发病。因此，这些方法在临床诊断中 Bb可经动物传染给人，并在免疫功能缺陷或低下的 并没有得到广泛使用。目前急需一种特异 、敏感的猪 人群(如 AIDS患者体内)形成严重感染，因此引起高 波氏菌病诊断方法 。 度关注 J。 Bb具有 O、K和 H抗原，其毒力因子包括粘附 基金项目：国家自然科学基金；国家 “863计划”(2OO6AAlOA2O6) ’通讯作者。Tel：+86．27Fax：+86．27E—mail：wub@mail．hzau．edu．cn 作者简