旋毛虫43ku ES抗原基因与保姆细胞形成相关性研究.docVIP

东北农业大学 硕士学位论文 旋毛虫43ku ES抗原基因与保姆细胞形成相关性的研究 姓名：王守育 申请学位级别：硕士 专业：预防兽医学 指导教师：路义鑫 摘  摘  要  要  旋毛虫是一种骨骼肌细胞内寄生的线虫，被感染的肌细胞会失去原有的组织特征，并转 变成一种新的组织结构——保姆细胞（Nurse Cells，NC），旋毛虫的排泄分泌（ES）蛋白被 认为参与了保姆细胞的形成过程，旋毛虫 43ku ES 抗原就是其中之一。 本研究旨在利用实时荧光定量 PCR 技术建立旋毛虫 43ku ES 抗原基因（Ts43）和小鼠骨 骼肌细胞调节因子 MyoD、Id1 基因表达量的测定方法。并用相应方法检测这些基因的表达动 态，为深入探讨 Ts43 基因的表达水平与保姆细胞形成的关系奠定基础。 根据 GenBank 中发表的旋毛虫的 Ts43 和 18S rRNA 基因序列，设计引物和探针。以管家 基因 18S rRNA 为内参基因，对旋毛虫总 RNA 进行归一化处理，利用标准曲线法计算出 Ts43 基因的表达量。应用该方法检测旋毛虫不同寄生时期（包括成虫、新生蚴、成囊前期幼虫和 肌幼虫）Ts43 基因的表达动态变化。研究结果表明，旋毛虫在各寄生时期均有 Ts43 基因的 表达，然而成虫和新生蚴 Ts43 基因的表达水平相对于其它寄生时期的虫体很低，该基因表达 量在感染后 18d 开始逐渐上升，于感染后 30d 达到高峰，而后开始逐渐下降，但至感染后 58d 的虫体 Ts43 基因表达水平仍高于成虫和新生蚴。 根据 GenBank 中发表的小鼠骨骼肌细胞调节因子 MyoD、Id1 和 G3PDH 基因序列，设 计引物。以管家基因 G3PDH 为内参基因，对旋毛虫总 RNA 进行归一化处理，利用Ct值 法计算出 MyoD 和 Id1 基因的表达量。应用该方法检测旋毛虫不同寄生时期（感染后 7d、14d、 18d、22d、26d、30d、34d、38d、48d 和 58d）和小鼠活体转染 Ts43 基因前后小鼠骨骼肌细 胞 MyoD、Id1 基因的表达动态变化。研究结果表明，小鼠骨骼肌细胞 MyoD、Id1 基因在开 始感染旋毛虫后，基因表达量持续增加。MyoD 基因表达量在感染后 26d 达到最高值，而 Id1 基因表达量在感染后 22d 达到最高值。之后，MyoD 基因表达量持续下降，在感染后 38d 回 到正常水平，而 Id1 基因表达量在达到最高值后迅速下降，在感染后 26d 时就回到正常水平。 小鼠活体转染 Ts43 基因后会使 MyoD 和 Id1 基因的表达量均有增加，但增加的时间不同， MyoD 基因在转染后 2d 表达量显著增加，而 Id1 基因在转染后 6d 时才有显著增加。保姆细 胞的形成涉及到肌细胞去分化和再分化，而 MyoD 和 Id1 基因都是重要的肌细胞调节因子。 本研究发现，在小鼠感染旋毛虫以后，小鼠骨骼肌细胞 MyoD 和 Id1 基因的表达量都发生了 明显的变化。说明 MyoD 和 Id1 基因很可能在保姆细胞的形成过程中发挥了重要作用。而小 鼠活体转染 Ts43 基因后会使 MyoD 和 Id1 基因的表达量均有增加，则进一步说明 43ku ES 抗 原很可能通过改变细胞调节因子的转录来参与保姆细胞的形成。 综上所述，Ts43 基因与保姆细胞的形成有较大的关系，而且 Ts43 基因很可能是通过细 胞调节因子来参与保姆细胞形成的。保姆细胞的形成涉及多个 ES 抗原蛋白和细胞调节因子， 要想真正了解保姆细胞的形成机制，还需要对它们进行深入的研究。 关键词：实时荧光定量 PCR，旋毛虫，保姆细胞，Ts43，MyoD，Id1 I 英文摘要 The correlation study between 43ku ES antigen of Trichinella spiralis and the formation of nurse cells ABSTRACT Trichinella spiralis is an intracellular parasitic nematode that infects in skeletal muscle cells, and the infected muscle cells would lost its intrinsic organization character and turn to a new tissue structure, Nurse cells. It was believed that excretory-secretory (ES) proteins of Trichinella spiralis are involved