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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T ××××-×××× 多子小瓜虫检疫技术规范 Protocol of quarantine for Ichthyophthirius multifiliis （草案） ××××-××-××发布 ××××-××-××实施 中 华 人 民 共 和 国 发 布 国家质量监督检验检疫总局 前言 本标准按照GB/T 1.1 -2009给出的规则起草。 本标准综合国内外有关多子小瓜虫的诊断技术和鉴定方法，并补充了起草单位多年的研究成果和检疫方法。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广东出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：郭书林、陈信忠、龚艳清、杨俊萍、孔凡德、叶妍妍。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。多子小瓜虫检疫技术规范 范围 本标准规定了多子小瓜虫的形态学和PCR检测和鉴定方法。 本标准适用于多子小瓜虫病的病原鉴定及其流行病学调查和监测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 滋养体 虫体进入鱼的皮肤或鳃开始，直到发育成熟并离开鱼体的多子小瓜虫虫体。 包囊 虫体脱离鱼体进入水中形成的包囊到包囊破裂阶段的多子小瓜虫。 试剂和材料 所有化学试剂均为分析纯。实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格，用于DNA提取及PCR实验的水需用灭菌双蒸水。Taq酶、dNTPs(含dATP、dUTP、dCTP、dGTP)等核酸提取及PCR所需试剂可选用商品化试剂和试剂盒。 阳性对照为多子小瓜虫滋养体。 PCR引物：正义引物：XGCF:5’-GTACTTTATTTAGGAGGAGGACT-3’，反义引物XGCR:5’-TGTTTAACGAGAGAAAATCATAAAT-3’。 绍丁氏固定液（Schaudinns solution）（附录A.1） 波恩氏固定液 (Bouin’s solution) （附录A.2） 海登汉铁苏木精染色液(Heidenhain’s iron haematoxylin) （附录A.3） 10%的甘油酒精（附录A.4） 抽提液1（附录A.5）。 抽提液2（附录A.6）。 TBE电泳缓冲液（附录A.7）。 核酸染色剂（EB）（附录A.8）。 上样缓冲液（附录A.9）。 器材和设备 普通PCR仪。 显微镜。 立体显微镜。 高速冷冻离心机。 解剖器具。 微量移液器。 电泳仪。 凝胶成像分析系统或紫外检测仪。 载玻片和盖玻片。 具有符合SN/T 1193的实验室。 实验室诊断 临床症状 小瓜虫病具有明显的临床症状，鱼体的皮肤、鳍条和鳃瓣上形成许多直径1 mm左右的小白点，严重时，躯干、头、鳍、鳃和口腔等处都布满小白点，体表似覆盖一层白色薄膜，有时眼角膜上也有小白点，并伴有大量粘液覆盖在体表和鳃丝上（见附录B）。因粘孢子虫病，打粉病等多种病，体表症状与多子小瓜虫病相似，所以临床诊断法仅可作为初步诊断。 虫体的收集 将鱼只放在清水缸中，让其自由游动，选择筛孔大小适宜的尼龙分样筛，收集从鱼体脱落沉集于缸底的成熟小瓜虫。或从活鱼皮肤、鳍、鳃、头、鳞片、角膜、口腔、眼部、鼻等病原主要寄生部位刮取组织样本。显微镜观察用虫体可用5%福尔马林固定保存，PCR检测用虫体和鱼体组织可保存于70﹪的酒精中，或于-20 ℃以下冻存备用。 形态学诊断 皮肤组织涂片法 涂片采集和检查 用一片干净的载玻片，轻轻地在鱼体怀疑被感染的位置按压，或者用载玻片的边缘在被感染部位轻轻滑动，刮取部分上皮细胞，或取鱼体体表白点放在有淡水的白瓷盘中，用2枚解剖针轻轻将白点的膜挑破，多挑几个，如见到有小虫体滚出，在水中游动，在低倍镜下观察，若发现具有多子小瓜虫的滋养体、包囊和幼虫的形态特征的虫体（见附录B），可确诊为小瓜虫病。该方法的灵敏度相对较低，对一些早期感染的病鱼，由于感染虫体数量少而容易漏检。对组织中的小瓜虫幼虫，也因其个体小，形态特征不明显，而可能出现假阴性。 涂片染色方法 组织涂片上滴加适量的绍丁氏液（附录A.1）进行固定。 加1～2滴碘酒50%酒精，使成淡茶色，洗去过多的固定剂，然后保存在70%的酒精中。 涂片先用蒸馏水水化，再用海登汉铁苏木精染色液（附录A.3）进行染色：先用4%的铁明矾媒染 30～60 min，经2次蒸馏水洗涤；再用0.5%染色液染30～60 min；最后2%的铁明矾进行分色。在显微镜