入境环保微生物菌剂检测方法 第1部分：地衣芽孢杆菌意见稿.docVIP

ICS点击此处添加ICS号 点击此处添加中国标准文献分类号 SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T —XXXX 入境环保用微生物菌剂检测方法 第1部分：地衣芽孢杆菌 Methods for examination of import microbe agentia for environment protection Part 1: Bacillus licheniformis 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 国家质量监督检验检疫总局发布 前言 本是根据GB/T1.1-1993《标准化工作导则 第一单元：标准的起草与表述规则 第1部分：标准编写的基本规定》的要求编写的。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。入境环保用微生物菌剂检测方法 第1部分：地衣芽孢杆菌 范围 本标准规定了。 本标准适用于。GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。对该菌进行形态学和生理生化试验，并进行，三项实验结果。 实验用水（应符合GB/T6682中一级水的规格）。：见附录A中A.1章：见附录A中A.2章TE缓冲液（pH值8.0）：见附录A中A.3章10×PCR缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl(pH 8.4),200 mmol/L氯化钾（KCl）15 mmol/L氯化镁（MgCl2）。dNTP: dATP、dTTP、dGTP、dCTP。TBE：54 gTris，27.5 g硼酸，800 ml去离子水溶解，20 ml 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)定容至1 L。Taq DNA聚合酶。细菌基因组DNA提取试剂盒。DNA分子量标记：100 bp DNA ladder。电子天平（感量0.01 g）。36 ℃±1 ℃、50 ℃±1 ℃ 恒温水浴锅。 台式离心机（最高转速15 000 r/min）。 PCR扩增仪。 实时荧光PCR仪。 头：10 μL、20 μL、200 μL、1000 μL。 PCR超净工作台。 电泳仪。 核酸/蛋白分析仪。 凝胶成像系统。 。 1 g（mL）100 μL。 地衣芽孢杆菌形态学及生化特征： 地衣芽孢杆菌为革兰氏阳性杆菌，细胞直径＜1 μm，很少成链，内生孢子，芽孢不膨大，不形成伴胞晶体。生化特征见表1。 地衣芽孢杆菌生化特征 鉴定项目 地衣芽孢杆菌 接触酶 + 氧化酶 + 厌氧生长 + 葡萄糖（厌氧） + 木糖 + L-阿拉伯糖 + 利用柠檬酸盐 + 硝酸盐还原 + 50 ℃生长 pH5.7生长 + 7%NaCl生长 + + 明胶液化 - 精氨酸双水解 + 细菌模板DNA的提取 直接提取法 取7.2中菌液2 mL加到2 mL无菌离心管中，10000 rpm离心2分钟，尽量弃净上清，沉淀加入TE100 μL、10 mg/ml溶菌酶100 μL，37 ℃温育30 min，12000 rpm离心2分钟，沉淀加入TE缓冲液600 μL重悬，再加入15 mg/ml蛋白酶Ｋ25μL，55 ℃温育1 h后沸水浴10 min，12000 rpm离心5分钟，取上清保存于－20 ℃保存以待检测。 有机溶剂提取法 取7.2中菌液2 mL加到2 mL无菌离心管中，10000 rpm离心2分钟，尽量弃净上清，沉淀加入TE缓冲液570 μL重悬，然后加入10 mg/ml溶菌酶100 μL，37 ℃温育30 min，再加入10 %SDS30 μL，65 ℃温育10 min，加入等体积的酚混匀，12000 rpm离心10分钟，取上清移入一新离心管中，重复一次，两次酚抽提后取上清加等体积的酚／氯仿（1:1体积比）混匀，12000 rpm离心10分钟，取上清再移入一新离心管中，加等体积的无水乙醇，1/10体积的3 mol/L乙酸钠，轻缓颠倒混匀，12000 rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用500 μL75 %乙醇洗两次，离心管开盖室温放置数分钟使乙醇挥发，加入100 μL无菌水（预先加热至65 ℃有利于DNA溶解），－20 ℃保存以待检测。 试剂盒法 使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。 DNA质量检测 将提取的DNA用1.0 %含溴化乙锭（或等效染料）的琼脂糖凝胶进行检测。然后用核酸/蛋白分析仪分别在260 nm和280 nm下测定OD值，用于PCR反应的DNA纯度一般为1.6≤OD260/OD280≤2.0。 PCR 引