出口食品中阪崎肠杆菌快速检测方法 胶体金法.docVIP

前 言 本标准GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准适用于出口食品中阪崎肠杆菌的快速筛选检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB 4789.40 食品安全国家标准 食品微生物学检验 阪崎肠杆菌检验 SN/T 1632.1 奶粉中阪崎肠杆菌检验方法 第1部分：分离与计数 原理 本标准采用胶体金免疫分析技术，将氯金酸用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒，标记抗体。以硝酸纤维素膜为载体，膜上有事先固定于检测带（T）的抗阪崎肠杆菌抗体和质控（C）的抗抗体。检测时，样品溶液在毛细管作用下向试纸条上端移动，此过程中阪崎肠杆菌与胶体金形成复合物，再与固定在膜上的抗体特异性结合，呈现红色。 溶液与试剂 除另有规定外，所有化学试剂均为分析纯，水应符合 GB/T 6682要求。 缓冲蛋白胨水（Buffer peptone water，BPW）：见附录A.1。 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin medium，mLST-Vm）：见附录A.2。 PBS缓冲液：见附录A.3 阪崎肠杆菌胶体金免疫层析快速检测试纸条。 仪器与设备30 ℃ ± 1 ℃、24 ℃ ± 1 ℃、35 ℃ ± 1 ℃。 均质器。 天平：感量0.1 g。 测定方法 121 ℃高压灭菌15 min～20 min，一套洁净工具限于一份样品使用。取样前消毒样品包装的开启处和取样勺。无菌取样品100 g（mL）至2 L的样品稀释瓶中，加入900 mL预热到45 ℃的缓冲蛋白胨水，或者将样品直接称量到装有9倍于样品重量，并已预热到45 ℃的缓冲蛋白胨水的样品稀释瓶中，振摇使充分混匀。 增菌培养 36 ℃±1 ℃培养18 h～22 h。 二次增菌 对于污染量较低的样品，可进一步将6.2的培养物移取1 mL 转种于10 mL mLST-Vm 肉汤，44 ℃±0.5 ℃培养24 h±2h后再进行胶体金试纸条检测。 胶体金试纸条快速检测 取增菌液500 μL，4000 rpm离心5 min，弃上清，加入100 μL PBS重悬沉淀，加入到胶体金试纸条的加样孔中，5 min～10 min 判定结果。 质量控制实验中以阪崎肠杆菌标准菌株ATCC 29544作为阳性对照，以水作为空白对照。 结果判定与分析 质控描述： 试纸条上质控带（C）不出现红色条带，结果无效，试纸条质控，阴性、阳性对照都正常是结果有效。 阴性结果： 试纸条上仅质控带（C）出现红色条带，检测带（T）无红色条带出现，则判定为“未检出阪崎肠杆菌”。 阳性结果： 试纸条上质控带（C）和检测带（T）均出现红色条带，则判定为“检出阪崎肠杆菌”。使用GB/T 2910.1和本部分6.3.1和6.3.2规定的设备。 报告方法 “未检出阪崎肠杆菌/100 g（mL）”。 胶体金检测为阳性：按照GB 4789.40或SN/T 1632.1进行分离确证实验后，报告为“检出阪崎肠杆菌/100 g（mL）”。 附 录 A （规范性附录） 培养基和试剂 缓冲蛋白胨水（BPW） 成分 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 9.0 g 磷酸二氢钾 1.5 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.2 制法 加热搅拌至溶解,调节pH，121 ℃高压灭菌15 min。 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（Modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin medium，mLST-Vm） 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨（mLST）肉汤 成分 氯化钠 34.0 g 胰蛋白胨 20.0 g 乳糖 5.0 g 磷酸二氢钾