蜱类携带粒细胞无形体的检测方法 编制说明.docVIP

《蜱类携带粒细胞无形体的检测方法》编制说明 工作概述 1.1 任务来源 本标准由国家质检总局卫生监管司提出立项，国家认监委批准立项并下达编制任务。 计划编号：2011B313k 类别：卫生检疫 标准名称：蜱类携带粒细胞无形体的检测方法 负责起草单位：辽宁出入境检验检疫局 1.2 目的和意义 粒细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum），即嗜吞噬细胞无形体，属立克次体目、无形体科、无形体属，是一种侵染人末梢血中性粒细胞的革兰阴性小球杆菌。通过蜱类传播，可引起人类粒细胞无形体病。 自20世纪初美国首次发现人粒细胞无形体病以来，澳洲多国、欧洲多国、韩国及我国多个地区先后发生该病的流行，且呈现逐年上升的趋势。因此，开展对蜱类及粒细胞无形体的检测工作，对保障国境口岸的卫生安全具有重要意义，急需制订相关的标准来指导和规范此项工作的开展。 本标准制定的检测方法灵敏度高、特异性好，能检测到粒细胞无形体特异性核酸片段；操作可靠性强，能较好地满足各国境口岸对蜱类的筛查检测工作。适用于国境口岸开展蜱类携带粒细胞无形体的检测工作以及相关的科研工作。 1.3 国内外相关标准概述 目前国内外无相同的国家标准、行业标准或已立项未批准发布的检验检疫行业标准。已有的相关行业标准包括《国境口岸蜱类监测规程》（SN/T 1293-2003）、 《国境口岸灭蜱规程》（SN/T 1602-2005）、《创建“国际卫生机场”规程》（SN/T 1269-2003）、《创建“国际卫生海港”规程》（SN/T 1296-2003）等。上述标准涉及国境口岸蜱类监测和卫生处理等内容，目前尚无蜱类携带粒细胞无形体的检测方法方面的行业标准。 标准的研制 辽宁出入境检验检疫局国家医学媒介生物监测检测重点实验室接到国家认监委下达的编制任务后，主要按以下几个阶段开始本标准的研制工作。 2.1 查阅资料与实验方案设计 组织标准研制人员学习GB/T1.1—2009《标准化工作导则》，掌握标准编写的相关知识。持续关注国内外关于粒细胞无形体病的研究进展情况，查阅收集与本标准有关的资料：包括国内外相关的法规和技术资料、文献资料等内容。在学习了解相关资料的基础上，多次组织编写人员讨论制定实验方案和标准框架，并向系统内专家征求意见，不断完善实验方案。 套式PCR引物的合成 在查阅大量粒细胞无形体相关文献的基础上，选取粒细胞无形体16S rRNA 基因设计套式PCR引物，外引物扩增片段大小为653bp，引物序列如下： 上游引物OUT-1：5’-TTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACG-3’ 下游引物OUT-2：5’-CACCTCTACACTAGGAAT TCCGCTATC-3’ 内引物扩增片段大小为389bp，引物序列如下： 上游引物IN-1：5’-GTCGAACGGATTATTCTTTATAGCTTG-3’ 下游引物 IN-2：5’-TATAGGTACCGT CATTATCTTCCCTAC-3’ 上述引物合成后用ddH2O水溶解，浓度为20μM，分装并置于-20℃保存备用。 模板DNA使用基因组DNA提取试剂盒提取模板DNA。 (1) 取蜱个体放入1.5 mL离心管内，加入650 μl Solution A和0.9 μl RNase A1，研磨成匀浆。 (2) 收集研磨好的匀浆液移至Collection Tube中。如匀浆体积不足650 μl，请补充Solution A到650 μl，65℃保温5 min。 (3) 加入400 μl Solution B，震荡混合。 (4) 加入1 mL的4℃预冷的Solution C ，充分混匀后，12000 rpm离心2 min。 (5) 弃去上层有机相，再加入1 mL的4 ℃预冷的Solution C ，充分混匀后，12000 rpm离心2 min。 (6) 弃去上层有机相，将水相溶液（无色下层）转移至Collection Tube上的Filter Cup中，12000 rpm离心1 min。 (7) 弃去Filter Cup，在滤液中加入400 μl DB Buffer，混合均匀。 (8) 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上，将g)中混合溶液转移至Spin Column中，12000 rpm离心1 min，弃滤液。 (9) 将500 μl Rinse A加入到Spin Column中，12000 rpm离心30 s，弃滤液。 (10) 将700 μl Rinse B加入到Spin Column中，12000 rpm离心30 s，弃滤液。重复操作此步骤。 (11) 将Spin Column置于Collection Tube上，12000 rpm离心1 min。 (12) 将S