蜱类携带粒细胞无形体的检测方法.docVIP

前 言 本标准根据GB/T1.1-2009 第1部分标准的结构与编写的相关规则编写。 本标准由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：辽宁出入境检验检疫局本标准主要起草人：本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 PCR检测方法 1 范围 本标准规定了国境口岸本标准适用于国境口岸携带的检测。 下列术语和定义适用于本。ick 不完全变态的节肢动物，分类学上属节肢动物门，蛛形纲，蜱螨目，蜱总科。蜱类营寄生生活，多寄生于哺乳类、鸟类、爬行类等动物体上，可分为卵、幼虫、若虫和成虫四个时期。 3.4 粒细胞无形体 anaplasma phagocytophilum 粒细胞无形体是严格细胞内寄生的革兰氏阴性无一定形状菌，属于立克次体目，无形体科，主要通过硬蜱传播，可引起人兽共患病。 4 检测对象 出入境交通工具、集装箱、货物所捕获所捕获。。实验室生物安全要求参GB 19489的规定执行，实验过程中做到如下几点： ——试验前应进行充分的准备，参与试验的人员要经过严格的培训，建立完善的试验方案。 ——有完善的防止蜱虫叮咬和逃逸措施。 ——建立意外事故(手套破裂、手外伤等)处理方案。 ——所有未经有效灭活的生物样品的操作均在具有相应生物安全级别的实验室内进行。 ——实验结束后对所有接触或可能接触到实验样品的物品（试验台面、手套、匀浆器等）及废弃样品进行有效消毒，杜绝随意丢弃。 6 器材与试剂 6.1 器材 冷藏箱、高速冷冻离心机、高压蒸汽灭菌锅、PCR扩增仪、烘箱、水浴锅、生物安全柜、匀浆器、移液器、PCR管、冻存管、离心管、塑料平皿、镊子等。 氯仿、外引物OUT-1及OUT-2、内引物IN-1及IN-2、10*PCR Buffer（含Mg2+）、dNTPs、DNA Polymerase、粒细胞无形体质粒DNA（MD20-T-OUT）、ddH2O、基因组DNA提取试剂盒等。 将的装入适当的容器（等），加贴标签。 标签内容至少包括以下信息：编号、采集时间、采集地点等。 分装完毕的样品，尽早送实验室。运送过程中防止逃逸。 NA提取 8.1.1 DNA提取方法 使用Universal Genomic DNA Extraction Kit（宝生物工程（大连）有限公司）进行基因组DNA提取，也可使用达同等效果的基因组DNA提取试剂盒，提取方法如下： 取蜱虫个体（单只或多只）放入1.5 mL离心管内，加入650 μl Solution A和0.9 μl RNase A1，研磨成匀浆。 收集研磨好的匀浆液移至Collection Tube中。如匀浆体积不足650 μl，请补充Solution A到650 μl，65℃保温5 min。 加入400 μl Solution B，震荡混合。 加入1 mL的4℃预冷的Solution C ，充分混匀后，12000 rpm离心2 min。 弃去上层有机相，再加入1 mL的4 ℃预冷的Solution C ，充分混匀后，12000 rpm离心2 min。 弃去上层有机相，将水相溶液（无色下层）转移至Collection Tube上的Filter Cup中，12000 rpm离心1 min。 弃去Filter Cup，在滤液中加入400 μl DB Buffer，混合均匀。 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上，将g)中混合溶液转移至Spin Column中，12000 rpm离心1 min，弃滤液。 将500 μl Rinse A加入到Spin Column中，12000 rpm离心30 s，弃滤液。 将700 μl Rinse B加入到Spin Column中，12000 rpm离心30 s，弃滤液。重复操作此步骤。 将Spin Column置于Collection Tube上，12000 rpm离心1 min。 将Spin Column置于新的1.5 mL离心管上，加入50 μl～100 μl的ddH2O，室温静置1 min。 12000 rpm离心1 min洗脱DNA，置于冰上待用或低温保存。提取过程中注意事项：——蜱类DNA的提取既可单只进行，也可多只混合提取。根据捕获样品数量、实验目提供，是适合市售产品的实例给出这一信息是为了方便标准的使用者并不表示对产品的认可如果其他等效产品具有同样的效果，则可使用这些。的等具体情况确定——操作全过程采取戴口罩、戴手套等措施——ddH2O等试剂应专用，避免交叉污染 根据粒细胞无形体16SrRNA核酸序列，设计并合成套式PCR的内、外引物。外引物OUT-1和OUT-2扩增的核酸片段长度653 bp，引物序列如下： 上游引物OUT-1：5’-TTGAGAGTT