三种危险性黄单胞菌基因芯片检测鉴定方法.docVIP

 前 言 本标准依据GB/T1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编制。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国伊利出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：龙海，李一农，李芳荣，余道坚，郑耘，冯建军，乾义柯。 三种危险性黄单胞菌基因芯片检测鉴定方法 范围 本标准规定了进出境植物检疫中水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola；Xooc) 、柑桔溃疡病菌（X.axonopodis pv. Citri；Xac）和甘蓝黑腐病菌(X.campestris pv.campestris；Xcc)的基因芯片检测方法。 本标准适用于进出境水稻及其产品中水稻细菌性条斑病菌，芸香科植物及其产品中柑桔溃疡病菌和十字花科植物及其产品中甘蓝黑腐病菌的基因芯片检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室　生物安全通用要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682-2008,ISO3696:1987,MOD) SN/T 2372 水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌的检测方法 SN/T 2622 柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法 术语、定义和缩略语 下列术语、定义和缩略语适用于本文件。 术语和定义 基因芯片 gene chip 核酸检测探针按照有序的行列格式点制在固相支持物上，通过特定温度下与相应样品进行杂交而用于样品中核酸种类定性分析的一种高通量技术。 基片 substrate 基因芯片中用于固定探针的基质，通常采用标准的“载玻片或其他固体载体”，经过化学修饰制备而成。 基因芯片探针 DNA microarray probe 基因芯片中固定于基质表面，能与样本DNA互补，用于探测样本DNA信息的核酸分子，本部分采样寡核苷酸片段做探针。 定位探针 positive position probe 是一段与待检测基因无关的寡核苷酸，通过和标记的定位探针互补链杂交显示信号，用于点样矩阵的位置的确定。 阳性质控探针 positive quality control probe 用于样品抽提、PCR、杂交等反应体系的监控，一般用生物的管家基因来设计阳性质控探针。 阴性质控探针 negative quality control probe 是一段与待检测基因无关的寡核苷酸，用于基因芯片非特异性杂交背景的监控。 基因芯片空白指控点 no probe microarray spot 由不含核酸的点样液点制而成，用于基因芯片杂交背景的监控。 目标基因探针 probe for target gene 用于检测目标基因序列的探针。 信噪比 signal noise ratio 是杂交信号值与杂交背景值的比值，由图像分析软件自动判读。 缩略语 bp; base pair 碱基对。 DNA; deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸。 dNTP; deoxyribonucleoside triphosphate 脱氧核苷三磷酸。 dGTP; deoxyguanosine triphosphate 脱氧鸟苷三磷酸。 dCTP; deoxycytidine triphosphate 脱氧胞苷三磷酸。 dTTP; deoxythymidine triphosphate 脱氧胸苷三磷酸。 Cy5-dCTP; cy5 dexycytidine triphosphate Cy5 标记的脱氧胞苷三磷酸。 EB; ethidium bromide 溴化乙锭。 NSC; no sample control 空白样本对照。 NTC; no template control 空白模板对照。 NC; negative control 阴性对照。 PC positive control 阳性对照。 实验室要求 实验室设施应达到GB 19489实验室技术要求。 方法原理 针对3种目标菌的铁载体受体（Putative siderophore receptor）基因序列和RNA多聚酶西格玛因子（RNA polymerase sigma factor, rpoD）基因序列设计引物和特异性探针。从待检样品中分离细菌，提取DNA为模板进行双重PCR扩增。扩增产物与固定有3种目标致病菌特异性探针的基因芯片进行杂交，用芯片扫描仪对杂交芯片进行扫描并判定结果。阳性结果