特异性抗体的制备技术（PowerPoint）.pptVIP

特异性抗体的制备技术 特异性抗体： 多克隆抗体（抗血清） 单克隆抗体（杂交瘤技术） 基因工程抗体 多克隆抗体：由某一抗原刺激机体后产生的抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同抗原决定簇的抗体的混合物，即多克隆抗体。 免疫血清制备技术 免疫血清：高效价、高特异性 高效价：动物的免疫反应性和抗原的免疫原性 高特异性：免疫用抗原的纯度 多克隆抗体（抗血清）的制备 抗原 半抗原+载体 佐剂 免疫动物（3-5次） 测效价 动物采血，分离血清 抗血清纯化、鉴定、保存 1.抗原制备 细胞性抗原或颗粒性抗原 可溶性抗原 方法 1）超速离心法 2）选择性沉淀法（盐析沉淀法） 3）凝胶层析法（分子筛层析） 4）离子交换层析 5）亲和层析 半抗原（多肽、激素、药物等） 绵羊红细胞 抗绵羊红细胞抗体（溶血素） 羊血+无菌生理盐水 洗涤3次（2000r/min?10min) 配成106/ml细胞悬液 2.载体 蛋白质：牛血清白蛋白、血蓝蛋白 多肽聚合物：多聚赖氨酸 大分子聚合物：羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮 3.佐剂 与抗原同时或预先注射于机体能增强机体免疫应答或改变免疫类型的物质. 应用最多的是福氏佐剂和细胞因子佐剂 福氏佐剂 不完全佐剂:液体石蜡+羊毛脂 完全佐剂:液体石蜡+羊毛脂+卡介苗 福氏佐剂：抗原=1：1 乳化成“油包水”乳液 完全佐剂一般不连续2次使用 细胞因子佐剂 IL-2 IL-1 IFNr CSF等 佐剂的作用机制 改变抗原的物理性状，延缓抗原的释放 增强巨噬细胞抗原处理、呈递能力 活化巨噬细胞，释放细胞因子增强淋巴细胞的应答能力。 4.免疫动物 选择动物:哺乳类和禽类 1)适龄、健壮、无感染 2）抗原与免疫动物种属关系：差异越远越好 3）抗血清量的需要：量大，选用马、羊等大动物，量小，选用兔、豚鼠 4）抗血清分为R（rabbit）型和H（ horse）型，R型免疫血清具有较宽的等价带，适于做诊断试剂；H型免疫血清等价带较窄，一般用于做免疫治疗。 免疫方法： 剂量：合适，太大，易引起免疫耐受 途径：多用皮内或皮下多点注射（足掌、背部两侧） 腋窝淋巴结直接注射 静脉、腹腔注射 间隔时间：第一次免疫 10-20天第二次免疫 7-10天 第三次，总次数5-8次。 5.免疫血清采集、分离及保存 采血前测抗体效价 采集：颈动脉放血、心脏采血、静脉采血 分离：室温自然凝固，血清56℃30min 保存：4℃保存—存放3个月至半年 低温保存—2至3年，忌反复冻融 冰冻干燥—4-5年 6.抗体的纯化、鉴定 目的：尽量除去抗血清中与目的抗体不相关的成分 单价特异性抗血清的纯化 单价特异性是指抗血清只与其特异性抗原发生反应。去除杂抗体 亲和层析法、吸附法 特异性IgG类抗体的纯化 硫酸铵盐析；凝胶过滤、离子交换或亲和层析 亲和层析法是将交叉反应的抗原交联到Sepharose4B，装柱后，将抗血清通过亲和层析柱。 吸附法是利用不含特异性抗原的抗原液，即不含用于免疫动物抗原的其它杂抗原液（如血清、组织液或已知的某种杂抗原），制备成固相吸附剂，直接加到 免疫血清中。 硫酸铵盐析：先用50%饱和度去除白蛋白，再用2次33%饱和度沉淀丙种球蛋白。 离子交换层析：常用的离子交换剂有DEAE纤维素和