肝癌患者手术前后外周血AFP mRNA定量检测的临床意义.DOCVIP

临床医学论文-肝癌患者手术前后外周血AFP mRNA定量检测的临床意义 【摘要】? 目的: 研究肝细胞肝癌患者手术前后外周血AFP mRNA表达量的变化，分析其作为微转移标记物的可行性及与复发转移的关系. 方法: 使用实时荧光定量RT－PCR检测64例肝细胞癌患者手术前后外周血AFP mRNA表达量, 并进行平均6 mo以上的随访；同时以8例肝硬化患者、4例肝增生患者、8例肝血管瘤患者和10例健康志愿者作为对照组，对比检测其外周血单核细胞AFP mRNA的表达量. 结果: 复发34例. HCC组的术前AFP mRNA表达量明显高于对照组.术前外周血AFP mRNA 相对HCC的灵敏度为85.9%，特异性为90.3%，准确率为87.4%. HCC患者术后外周血AFP mRNA表达量明显高于术前.HCC组外周血术前、术后AFP mRNA水平表达量与术后复发转移有明显相关性，与TNM分期、血管癌栓或侵犯有相关性，但与术时肿瘤数目、癌细胞分化程度、包膜完整性均与血清AFP浓度无相关.术后HCC组外周血AFP mRNA表达量与肿瘤大小有相关性. 结论: 实时荧光定量RTPCR法检测HCC患者外周血AFP mRNA表达量有很高的敏感性和特异性，可以反映HCC患者血中是否存在肝癌细胞.手术可促进部分HCC细胞脱落入血.监测外周血AFP mRNA水平对术后早期复发转移有预测价值. 【关键词】? 癌 肝细胞 甲胎蛋白 RNA 信使 逆转录聚合酶链反应 肿瘤转移 ??? 0引言 ??? 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC) 是我国常见的恶性肿瘤之一, 根治性切除术是其最有效的治疗选择，但术后易复发，血源性播散是HCC复发转移的主要途径，因此早期发现外周血中微转移对于HCC的临床治疗和预后评估具有重要意义.甲胎蛋白(alphafetoprotein, AFP)mRNA是HCC微转移检测常用的标志物［1］, 但是其应用价值存在争议［2］，故本研究应用实时荧光定量RTPCR技术检测HCC患者手术前后、对照肝病患者和健康志愿者外周血的AFP mRNA，分析AFP mRNA可否作为循环HCC癌细胞标志物，手术操作对HCC微转移的影响，以及与术后复发转移的关系. ??? 1对象和方法 ??? ?1.1对象前瞻性分析西南医院肝胆外科研究所自200509/200608初次入院治疗的HCC患者64（男57, 女7）例, 年龄25~69(46.0±10.6)岁，均行影像学(B超、CT和DSA)及血清甲胎蛋白(AFP)检测, 并经术后病理证实为肝细胞癌患者，其中I期34例，II期患者16例, III期11例, Ⅳ期3例.血清AFP＞20 μg/L者47例.HCC患者术前肝脏储备功能评估：15 min吲哚靛青绿储留率(ICGR15)均＜15%（平均5.5%）；ChildPugh 评分A级60例，B级4例.所有手术均为开腹手术，其中行解剖性切除术27例，行非解剖性切除术37例.术后平均随访6 mo以上.对照组患者:肝硬化8例；肝脏增生4例，肝脏血管瘤8例，正常对照10例. 人淋巴细胞分离液由天津中科院生研所灏洋生物制造；RNA 提取试剂盒RNAiso Reagent和实时荧光定量RTPCR 试剂盒（SYBR Premix Ex TaqTM, Perfect Real Time）均为宝生物工程（大连）有限公司产品.Beckman CS15R高速冷冻离心机为美国Beckman公司产品；PCR system 2700型PCR仪为美国PE公司产品；LightcyclerⅡ荧光定量PCR仪为德国Roche公司产品. ??? 1.2方法 ??? 1.2.1外周血标本HCC组患者分别在手术切皮前及关腹后从深静脉置管内抽取静脉血5 mL，肝硬化组、肝脏增生组、肝血管瘤组患者也术前从深静脉置管内抽取静脉血5 mL，健康志愿者抽取肘静脉血5 mL，均肝素抗凝后，用人淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞.分离的单核细胞－80℃冰箱保存，待统一提取RNA.AFP表达阳性对照细胞系HepG2细胞株由本所实验室保存提供. ??? 1.2.2总RNA的提取及测定按照宝生物公司的RNA提取试剂盒RNAiso Reagent进行.用紫外分光光度仪测量OD 260/280比值并评估RNA的纯度，根据OD 260/280比值计算总RNA的含量.RNA的完整性用10 g/L琼脂糖凝胶电泳显示. ??? 1.2.3引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，所用引物，AFP mRNA引物序列如下：正义链：5TCA GTG AGG ACA AAC TAT TGG3，反义链：5CTC TTC AGC AAA GCA GAC TTC3；βactin正义链：