水牛MyD88 cDNA的克隆与原核表达.pdfVIP

基因组学与应用生物学，2011年，第 3O卷 ，第 2期，第 190—196页 GenomicsandAppliedBiology，2011，Vo1．30，No．2，190—196 研究报告 A Letter 水牛MyD88cDNA的克隆与原核表达 张晓茹 匡文华 ， 成鹰 ：杜丽 张冬琳 z 郝永 昌 雷明 焦寒伟 刘涛 祁超 王凤阳 ” l华中师范大学生命科学学院，武汉，430079；2海南大学农学院，海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室(筹)，海 口市动物基因工程重 点实验室，海 口，570228 +同等贡献第一作者 通讯作者．qichao@mail．ccnu．edu．cn；fywang68@hotmail．corn 摘 要 采用 RT．PCR方法从水牛外周血 白细胞总 RNA 中扩增 出髓样分化因子 88(mydoiddifferentia- tionfactor88，MyDS8)cDNA序列，PCR产物分离纯化后，与pMD20一T载体连接，重组质粒经PCR、酶切鉴 定后测序 ，并进行生物信息学分析 ；构建 pET28a．MyD88表达载体 ，并将其转化至 E coliBL21(DE3)，经 IPTG诱导表达后，进行 SDS—PAGE、镍柱亲和层析纯化和Westernblotting分析。结果显示，克隆到的水牛 MyD88cDNA全长为 1189bp，含有 1个 891bp的开放 阅读框 ，编码 296个氨基酸，理论等 电点为 5．65。经 IPTG诱导表达后 ，得到一个带 His·Tag的约 39kD 的重组融合蛋 白。用抗 His单克隆抗体进行 Western blotting，得到 1条约 39kD特异性抗体结合带，表 明水牛MyD88原核表达载体成功构建并表达。本研究为 进一步开展水牛MyD88的结构功能分析奠定了基础。 关键词 MyD88，水牛，基因克隆，原核表达 GeneCloningandProkaryoticExpressionofMyD88cDNA from Buffalo ZhangXiaoru KuangWenhua ， ChengYing DuLi ZhangDonglin HaoYongchang LeiMing JiaoHanwei LiuTao QiChao WangFengyang” 1CollegeofLifeSciences，HuazhongNormalUniversity，Wuhan，430079；2CollegeofAgriculture，HainanUniversiyt，HainanKeyLabofTropieal AnimalReproductionBreedingandEpidemicDiseaseResearch (ConstructionPeriod)，AnimalGeneticEngineeringKeyLabofHaikou，Haikou， 570228 Theauthorswhocontributeequally ”Correspondingauthor，qichao@mail．ccnu．edu．cn；fywang68@hotmail．com DOI：10．3969／gab．030．000190 Abstract Mydoiddifferentiationfactor88(MyD88)cDNAwasamplifiedfromtotalRNAofperipheralblood leukocyteinbufral0bvRT．PCR andclonedintopMD20一T vectorafterpurified．Therecombinantplasmidwas confirmedbyPCR，endonucleasedigestion，sequencingandbioinfomr aticsanalysis．ThePCR productwasthen subclonedintopET28avectorandtransofrmedintoE coliBL21(DE3)．Proteinexpressionwasinducedby TG， purifiedbyNi—NTA superflow cartridgeandanalyzedbySDSandW estern blouing．Theresultsshowed thattheMyD88cDNA was1189bpinlengthandcontaineda891bp0RF，encoding296am inoac