Alzheimers病动物模型的建立及其分子病理学的研究.pdfVIP

中文摘要 目 的 窿年性痴呆(Alzheimersdisease,AD)是一种以进行性认知障 碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病，随着世界老龄 化的日益严重，AD越来越严重地危害着人们的健康。尽管近年 来AD分子生物学和遗传学研究有了许多新的突破，但其关键机 理尚不清楚，因此，建立理想的AD动物模型对探明AD的发病机 理至关重要。 分子病理学研究发现，AD患者脑部主要有4种基本病变:基 底的胆碱能神经元丧失、神经纤维缠结(NFT)、老年斑(SPS)、脑 淀粉样血管病变等。已经证实老年斑与血管淀粉样变的主要成分 是p一淀粉样蛋白(p-AP)，是由淀粉样前体蛋白(人PP)裂解而 来。 NFT主要成分是微管相关蛋白，即异常磷酸化的Tau 蛋白J本实验采用MRI,r一刀立体定位射频热凝损毁老年猴脑的 弯隆一海马伞，并通过检测其Tau及APP蛋白、乙酸胆碱酷酶 (AchE)，胆碱乙酞转移酶(ChAT)的方法进行验证，以建立AD动 物模型。 / 材料与方法 ! 、 1.采用MRI,r一刀立体定位系统及射频热凝方法毁损猴脑右 侧的弯隆一海马伞。 2.经猴颈动脉灌注生理盐水及4%的多聚甲醛，灌注后取脑 组织，放人25%的蔗糖磷酸缓冲液(0.lmol/L)保存15小时，用恒 冷切片机对脑组织的相应部位进行连续的冠状切片，片厚10- 40NLmc 3.AchE的组织化学法:按Hedreen方法进行染色。用网格测 试系统计数各部位AchE阳性纤维与测试线的交点数，以。 01m扩内阳性纤维与测试线交点数表示AchE阳性纤维密度。对 照组染色去掉底物，其余方法同上。 4.抗APPA4、抗Tau、抗ChAT免疫组织化学染色:取猴脑各部 位组织冰冻切片，采用ABC法，DAB显色。同时设不加一抗的空 白对照。 5.免疫印迹法(Westernblotting):取非痴呆老年患者脑颜叶 皮质及24岁老年猴的颈叶、额叶皮质及海马各0.5克，经SDS- 聚丙烯酞胺凝胶电泳后，转移至硝酸纤维素膜上，加单抗，染色。 结 果 1.弯隆一海马伞毁损后，实验猴反应迟钝，萎靡不振。 2.AchE阳性纤维密度定量分析:5只猴子的损伤(右)侧海马 CAI区的AchE阳性纤维密度明显低于对侧未损伤的对应区的纤 维密度(P0.01);青年猴的纤维密度比老年猴的略高。 3.APP。的表达情况:3只老年猴的大脑皮质的大锥体神经元 胞体中均可见APP,的免疫活性物质沉着，主要分布于神经元细 胞的核周围、轴丘和近端树突，间质可见斑块样沉积，有的斑块呈 弥漫颗粒状，主要分布于海马、内侧颖叶、额叶皮质及扣带回，而顶 叶及枕叶未见老年斑。皮质小动脉周围有胶质细胞浸润。2只青 年猴各部位未见老年斑及血管壁淀粉样改变。 4.Tau蛋白的表达情况:3只老年猴脑皮质的大锥体细胞浆均 可见抗Tau免疫活性物质主要分布于胞浆外侧部、轴突及树突底 部，星形胶质细胞浆中也可见阳性物质。在海马、颜叶及额叶皮 质、扣带回可见阳性物质呈条块状、火焰或卷发状以极浓的颜色在 神经元胞体内积聚，形态上有的近似人AD的神经原纤维缠结，其 他部位未见阳性物质表达。2例青年猴均未见神经原纤维缠结改 变。 5.APP,,Tau免疫印迹:非痴呆老年患者及老年猴脑组织免 疫印迹结果显示猴脑海马、颗叶及额叶皮质出现的APP,及Tau 免疫活性蛋白电泳带，与非痴呆老年患者的电泳带相一致。 6.ChAT的表达情况:5只猴大脑损伤侧内侧隔核的ChAT阳 性神经元的数目明显少于对侧，2只青年猴的ChAT阳性神经元的 数目略高于3只老年猴。 讨 论 CrowtherRA等认为，AD的神经纤维缠结是细胞骨架的异常 改变，以成对的螺旋丝(PHF)为特征，而异常磷酸化的Tau蛋白是 PHF的主要成分。Arispe等指出，p一AP增加神经元对兴奋性毒 性的敏感性，可导致APP分解过程异常及神经元退行性变。Bons 及Nelson等研究发现老龄动物脑中的淀粉斑块及神经纤维