C57BL6小鼠脾细胞中CD4、CD8细胞及其分泌的细胞因子IL4、IFNγ增龄性变化分析.pdfVIP

中 文 摘 要 前 言 衰老或老化(senescence)是一切生物体不可避免的生理现 象，主要表现为机体对环境刺激的适应能力减弱甚至丧失。衰老 在免疫系统中表现最明显的是T细胞的机能和数量的改变。T细 胞随着年龄的增加而有以下的变化:T细胞数量的减少;T细胞亚 群的改变;;T细胞质量发生改变以及T细胞功能下降。 _彻胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经过抗原刺激而分 泌的 ‘类生物活性物质，对细胞的发生、增殖、分化发挥重要的作 用 细胞因子中IFN一，,IL一2主要参与细胞免疫A 一4,IL一5, L I 一10则与体液免疫 近年来对细胞因子 蕊老化中所发挥的作用的研究得到了 广泛的关注。随年龄增长，T细胞分泌的细胞因子会发生改变，但 是不同的研究小组实验所得出了不同的结论。 本实验应用流式细胞术对不同年龄组的小鼠脾脏T细胞亚群 CD4+,CD8十细胞，及其产生的细胞因子IL-4,IFN一，进行检 测，探索衰老过程中细胞因子的变化规律，为进一步研究衰老引起 的T细胞的功能改变提供参考。 场 料与方法 1动物: 选用C57BL一6小鼠，根据周龄(3周，8周，12周，23周，55 周，107周)将小鼠分为6组，每组8只，雌雄各半，分开饲养。 2试剂与仪器: ·1· 试剂: PMA;Ionomycine;Golgistop;FcBlock;cytofix/cytoperm; buffer液;Turksolution;FBS(胎牛血清);RPMI一1640;抗小鼠IL 一4抗体(PE);抗小鼠IFN一，抗体(PE);抗小鼠M e+抗体 (FITC);抗小鼠CD4+抗体(FITC);抗小鼠CD8十抗体(PE); PBS(一)。 仪器: 离心机，流式细胞仪，二氧化碳恒温孵育箱，光学显微镜。 3实验方法: 1)脾细胞悬液的制作:取小鼠脾脏放人金属网上研磨，然后 过滤，离心两次，形成脾细胞悬液。 2)脾细胞计数:试管加人细胞悬液0.1毫升，细胞染液Turk 液0.9毫升，混匀，滴人计数板，光学显微镜下计数，计算细胞悬液 的浓度，依据细胞浓度将细胞悬液的浓度调制到2x106/M1. 3)脾细胞的细胞因子荧光抗体的染色 a脾细胞的活性化 取稀释后的PMA12微升，Ionomycinel0微升，Golgistop7微 升，加人调制好的细胞悬液1毫升，充分混匀，放人二氧化碳恒温 箱，孵育4小时 b脾细胞表面染色 试管中加人3倍稀释的FcBlock9微升，4℃保存15分钟，加 人3倍稀释的抗小鼠M e十抗体9微升，4℃保存30分钟。 。脾细胞内部染色 试管中加人Cytofix/cytoperm原液250毫升，4℃保存20分 钟，后再加人用去离子水10倍稀释的Buffer液1毫升，然后分别 加人PBS(一)3倍稀释后的抗小鼠IL-4,IFN一，抗体9微升，混 匀，4℃保存30分钟。 4)小鼠脾细胞中CD4+,CD8+细胞的染色:试管中分别加人 ·2 · 一一一一~~.~ 3倍稀释的抗小鼠CD4+,CD8+两种荧光抗体，棍匀，4℃保存30 分钟，加人去离子水10倍稀释的Lysingsolution1毫升，4℃保存 10分钟，离心弃上清，加人含1%FBS的PBS(一)0.5毫升，混匀， 4℃保存，待测。 5)流式细胞仪的使用:流式细胞仪所用的软件为CellQuest, 细胞仪所需要的条件用CaliBRITEBeeds预先设置好，采用双色标 准(2一ColorStandard)。每个标本选取10000个细胞进行流式分 析，所得结果均为百分数。每组标本所测得数据用Excel软件制 图，进行相