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嘉峪关魏晋墓腐蚀壁画真菌群落组成分析 　　内容摘要：微生物腐蚀与降解是嘉峪关魏晋墓砖壁画保存过程中所面临的主要问题之一。本研究采用现代分子生物学技术，对造成魏晋墓砖壁画腐蚀的真菌类群进行了检测和分析。通过样品总DNA提取，目标片段扩增，克隆文库构建，序列测定与比对后发现，魏晋墓腐蚀砖壁画真菌序列主要隶属于曲霉属、Phialosimplex属和侧齿霉属。常年受人为扰动，墓室内腐蚀砖壁画真菌多样性下降，群落结构发生改变。墓室常年开放或常年关闭均不利于砖壁画的长久保存。分子技术在快速、准确检测壁画微生物群落组成方面优势明显，应加以推广应用。 　　关键词：魏晋墓；砖壁画；微生物腐蚀；分子检测；真菌类群；文物保护 　　中图分类号：K854.3 文献标识码：A 文章编号：1000-4106（2013）01-0060-07 　　1 引言 　　关于壁画和历史遗迹表面微生物生态学及其环境保护的研究可以追溯到20世纪50年代末期。由于不同类型壁画的制作材质和工艺不同，其附存的环境多种多样，因而与它们相关联的生物群落也存在很大差异[1-3]。已有研究表明，腐蚀壁画微生物主要有以青霉属、曲霉属、枝孢霉属和Engyodontium为主的真菌[4]，以芽孢杆菌属、节杆菌属、微球菌属和假单胞菌为主的细菌[5]，以念珠藻属、鞘丝藻属和绿球藻属为优势种属的藻类[6]，以链霉菌属和诺卡氏菌属为主的放线菌[7]及壳状地衣[8]等。这些微生物的生长和代谢不仅会影响壁画的美学价值，而且会造成壁画的结构性损坏[9，10]。 　　旅游开放对洞窟环境影响方面的研究是近年来文物保护领域关注的热点。法国拉斯科史前洞穴在1948年开始对游客开放，但于1963年被迫关闭。究其原因，是游客参观访问改变了洞穴内原有环境，导致不同类型的微生物相继爆发，影响到壁画的色度和结构[10]。同样，光合细菌和异养微生物的蔓延使得西班牙阿尔塔米拉史前洞穴自2002年停止对游客开放，经过一系列环境控制后，岩洞是否可以重新开放尚待进一步的科学评估[11]。埃及图坦卡门墓经过近30年的旅游开放，墓穴壁画保存环境日益恶化，微生物污染问题严重，在近期不得不宣布暂停对游客开放[12]。与此同时，许多珍贵的洞窟已经禁止参观并被完全封闭，以期恢复洞窟中原有的生态环境系统[13]。研究发现，游客的进出对莫高窟洞窟内空气微生物群落的组成和结构影响很大[14，15]。这些研究成果均表明游客的参观活动对壁画原有保存环境产生了极大的扰动，并对其原本脆弱的生态系统造成了严重的冲击。 　　近年来，分子生物学检测方法因其敏感性和不依赖于样品中微生物的培养而广受研究者青睐，因其可在短期内得到腐蚀微生物群落组成和结构方面的重要信息[16-18]。截至目前，国内对腐蚀壁画微生物类群的研究还较少[9]，对于墓室这种特殊环境下的微生物调查则更少[19]。本研究利用分子生物学检测技术对被誉为“世界最大的地下画廊”的嘉峪关魏晋壁画墓（六号墓和七号墓）内腐蚀壁画的真菌进行了检测，对腐蚀壁画的真菌群落组成进行了分析。本研究将为国内开展文物的微生物腐蚀监测提供新的理论依据与技术支撑，有利于墓室环境下微生物腐蚀机理的深入研究和文化遗产的长久保存。 　　2 样地简介与实验方法 　　2.1 样地简介 　　嘉峪关魏晋砖壁画墓位于甘肃嘉峪关市东北20公里的新城戈壁滩上，古墓群分布长达20多公里。六号墓和七号墓相距约500米，发掘于1972-1973年间。目前六号墓对外开放，七号墓暂未开放参观。前期现状调查发现，两座墓均存在构造砖受压裂缝、破损和脱落，局部颜料层产生起甲、酥碱甚至脱落现象，部分砖壁画表面存在微生物菌斑等病害。 　　2.2 实验方法： 　　（1）样品采集及总DNA提取 　　在壁画微生物病害区域，用无菌解剖刀刮取少量带有菌斑的砖壁画样品，装入无菌Eppendorf管中，用分析天平称取0.1g，使用PowerSoilTM（MOBIO Laboratories，Solanabeach，CA，USA）DNA提取试剂盒，根据操作说明完成腐蚀壁画微生物总DNA的提取，分装后置于-20℃保存备用。 　　（2）目标片段扩增 　　以总DNA为扩增模板，真菌rRNA 基因内转录间隔区（ITS）扩增选择通用引物ITS1和ITS4 [20]。反应体系（25μl）包括1U的Taq聚合酶，终浓度为0.2mM的dNTP，2.5μl10×反应缓冲液，单条引物浓度0.2mM，以及2.0μl模板（大约含有10ng DNA）。扩增程序为：预变性94℃5min，然后在94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，完成30个扩增循环，终延伸72℃10min。用1% 琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的大小与特异性。 　　（3）克隆文库构建 　　使用琼