ALR-EGFP真核表达载体构建、在大鼠体内表达及其抗肝损伤作用实验研究.pdf

中文摘要 ALR—EGFP真核表达载体的构建、在大鼠体内的表达 及其抗肝损伤作用的实验研究 摘 要 目的：肝再生增强因子(ALR)是从新生大鼠肝组织中 克隆到的一种肝增殖刺激因子，能特异地刺激肝细胞增殖， 是肝再生的重要调控因子，能提高中毒性肝损伤动物的存活 率，在肝损伤修复过程中发挥作用。本研究拟构建ALR与 增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白真核细胞表达载体， 将GFP基因作为标记基因，以基因治疗的方式，观察ALR 基因给予CCl4诱导的肝损伤大鼠后，绿色荧光蛋白在肝组织 和其它组织内的表达情况，肝组织病理及肝损伤的恢复情况 等，探讨ALR基因对急性肝损伤的保护作用，以期为ALR 临床救治急性肝病提供理论依据和新的治疗方法。 方法：以本室保存的质粒pBV-220．ALR为模板，用合 变性3Osec，50℃退火20sec，72℃延伸1Osec，3O个循环结束 纯化，并经EcoRI及SalI双酶切后，与相同酶切的真核高 效表达载体pEGFP．C2进行体外定向重组，连接产物转化感 受态E．cDZz DH5仅。于含卡那霉素的LB培养基筛选重组子， 对阳性重组子进行酶切鉴定和测序。测序使用Sanger双脱氧 末端中止法。鉴定正确后，进行重组质粒的大量抽提并纯化， 中文摘要 的建造。四小时后，按不同注射剂量，不同注射途径，不同 时间点等，随机分为8组。具体分组如下：第一组：模型组； 1 第四组：肌肉注射 注射pEGFP．C2．ALR，OO“g／l(g； 第五组：静脉注射 pEGFP—C2。ALR，200IJLg／l(g； 第六组：腹腔注射 pEGFP．C2．ALR，200“g／kg； pEGFP—C2。ALR，200¨眺g；第七组：肌 肉注射 pEGFP—C2一ALR，200¨眺g；第八组：肌肉注射 pEGFP—C2一ALR，200¨g／l(g。2～6组每12小时注射一次， 共注射4次，末次注射后12h断头处死动物；7～8组每12小 时注射一次，共注射4次，分别在末次注射后24、60小时 后处死动物。另取4只大鼠为正常对照组。动物处死后，于 肝右叶固定部位取肝组织，同时取肾组织，做冰冻切片，在 荧光显微镜下观察各组的荧光蛋白(GFP)表达情况。同时 取肝右叶组织，做石蜡切片，行衄染色，进行肝组织病理 学检查，并对肝的损伤恢复情况进行鉴定。计量资料以均数 加减标准差(夏土SD)表示，组间差异采用单因素方差分析 (ANOVA)，两两比较采甩LSD检验。等级资料采用秩和检 验。所有数据均利用SPSS11．5软件包分析。 结果：构建的pEGFP—c2一ALR重组质粒目的基因与文献 报道的大鼠ALRcDNA编码区序列相同；大量制备的重组质 粒pEGFP—C2一ALR，提纯后再次经酶切鉴定，除可见预期的 特异性条带外，未见其他的非特异性条带，紫外分光光度计 察各组的荧光蛋白(GFP)表达情况，各ALR治疗组均在肝 组织内有数量不等的荧光细胞出现，而且表达的融合蛋白较 中文摘要 均匀的分布于整个细胞，表明ALR基因进入到肝细胞并获 得了有效表达。结果表明200pg瓜gALR较50¨g爪g、1oO¨眺g ALR的荧光细胞多，荧光蛋白表达量大；ALR不同注射途 径荧光蛋白表达量为肌肉注射静脉注射腹腔注射；不同时 间点的荧光蛋白表达量为末次注射后24小时末次注射后 12小时末次注射后60小时；而在肾组织未发现有荧光蛋白 的表达。光学显微镜下观察经皿染色的石蜡切片，以肝损 伤的分级标准为诊断依据。结果为，各ALR治疗组均不同 程度地减轻CCl4诱导急性肝损伤大鼠肝组织病理损害。具体 ALR恢复效果好； 为200“g／kgALR较50“g爪g、1OO肛g／kg ALR不同注射途径恢复效果依次为肌肉注射静脉注射腹 腔注射；不同时间点的恢复效果为末次注射后60小时末次 注射后24小时末次注射后12小时。