农杆菌介导的紫花苜蓿高效遗传转化体系的研究.pdfVIP

草业科技创新与草业发展 农杆菌介导的紫花苜蓿高效遗传转化体系的研究 徐春波1王勇2赵海霞1李兴酉1 (1．中国农业科学院草原研究所，内蒙古呼和浩特010010； 2．内蒙古农业人学生态环境学院，内蒙古呼和浩特010018) 摘要：为建市高效的农杆菌介导的紫诧苜蓿的遗传转化体系，对影响转化体系的若干因素进行了研究。 结果表明，最适宜的条件分别为抗菌素为350 mg／L的羧：常青霉素(Carb)；卡那霉索(Kan)筛选的浓度为 min；乙 60rag／L：基因型为WL-323：外植体为F胚轴；农杆菌荫液浓度ODeoo值为0．4．0．6；侵染时问10 酰，J．香酮(AS)的浓度为10mg／L． 关键词：紫花苜蓿，遗传转化，农杆菌介导 sativa L．)被誉为“牧草之王”，它不仅营养价值商、适口性好、 紫花莒蓿(Medicago 适应性强，而且对生态环境治理、同士护坡、防止水土流失也起到非常重要的作用，是全世 界广为种植的优良牧草。近年来，随着生物技术的发展，转基因技术已成为饲J}{jl牧草和作物 遗传改良的有效途径【l翔。迄今，通过农杆菌介导途径进行的作物转摹因研究已取得了重大 进展[3-Ⅻ。该技术方法也是苘蓿幕因转化最成熟的途径II¨。早在1986年，Deak。Webb就分 别通过农杆菌转化法成功地将nptII基冈导人苘蓿，并获得了可行抗性植株[12．t31。但是转倦 效率较低一直是用扰苜蓿基凶改良的一个霞婴凶素。因此，为建‘讧高效的农杆菌介导的紫花 苜蓿的遗传转化体系，本试验对影响农杆菌转化的各种凶素进行了系统地研究，以期建矗高 效的遗传转化体系，为紫花苜蓿的基因上程育种奠定基础。 l材料‘j方法 1．1．1植物材料 紫花苜蓿的4个品种“中苜l号(M．sativaL．CV．ZhongmuNo．1)”。“公农1．弓(M．sativi。 No．1)”，“猎人河(M．sativaL．CV．HunterRive)”和“WL-323(M．smivaL． L．CV．Gongnong CVWL．323)”。 1．1．2菌株和质粒 农杆菌菌株为C58。质粒为PBll21-CBFI(含有CBFl基冈和Kan抗性基因)。 1．1．3培养基 预培养、共培养、愈伤诱导培养基：改良SH+2，4-D(4．Omen．)+6-BA(0．5mg／L) 继代培养基：MSO+NAA(O．5 mg／L)+6一BA(0．5mg／L)+AgN03(1．0mg／L) 分化培养基：MS 生根培养基：I／2MS ·项目资助：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(中国农业科学院草原研究所)项目资助 (2006-1-01) 作者简介：徐春波(1979-)，女，内蒙古扎兰屯人，助研，硕士，主要从事牧草种质资源、遗传育种与生物 技术研究工作。Emaii：xcb972002@163．cDm 231 草业科技创新与草业发展 农杆菌培养基：YEB培养基 1．2方法 1．2．1抗菌素及其浓度的确定 mg／L的Carb和头孢霉素(Cef)的YEB液体培养基中加入菌液培养后，以未加抗生素的液 体YEB为对照，在波长600nm下用分光光度计测定其OD600值，每个处理重复3次，计 算出三个重复样品的01)600值的算术平均值。 素共培养基上，30d后分别统计胚性愈伤组织的诱导率。 1．2．2 Karl筛选压的确定 将外植体和生长30d的愈伤组织分别接种于含有0．10．30．50，60，70，90，llO mg／LKan的愈伤诱导培养基和分化培养基上，30d统计外植体的出愈率和分化率。 1．2．3不同基冈型对转化的影响 对4个紫花苜蓿品种的相同外植体分别进行农杆菌侵染，共培养3d后进行GUS 组织化学染色分析。 i．2．4不同外植体类型对转化效率的影响 分别侵染同一苜蓿品种的叶片．叶柄，茎段．子叶、下胚轴5