蔗糖梯度离心纯化人类中期染色体.pdfVIP

遗传 HEREDITAS(Beijing)19(6):25一261997 蔗糖梯度离心纯化人类中期染色体① 施家琦 唐冬生 夏家辉 湖（南医科大学医学遗传学国家重点实验室．长沙410078) PurificationofHumanMetaphaseChromosomes bySucroseGradientCentrifugation ShiJiaqiTangDongsheng XiaJiahui (NationalLaboratoryofMedicalGenetics,HunanMedicalUniversity,Changsha410078) 快速获得大量结构完整不含细胞质和细胞核、单个较纯的某号染色体是许多研究工作的基础，如染色体的电 镜结构分析、染色体结构蛋白的生化分析及初步纯化、制备整条染色体探针池、基因定位、基因克隆、文库构建 及遗传性疾病的诊断等许多基础和临床研究 ’〔一4〕．用流式细胞分类仪分选染色体，虽然纯度较高，但是分离纯化 染色体的速度较慢，耗时较长，做一次酶切所需的染色体要3-4个工作日才能分选出来 ”〔。为了解决上述问题， 迅速而大量地制备能满足不同层次研究工作需要的染色体，并提高纯化染色体的效率，我们以prescottc6)介绍的 分离中国仓鼠细胞染色体的方法为基础，摸索出一种较为简便的初步分级纯化人类染色体的方法。 1材 料 和 方 法 1.1实验材料 正常人外周血淋巴细胞株本（室提供；）1,6一己二醇上（海化学试剂站分装厂）；蔗糖广（州化学试剂厂）。 1.2实验方法 1.2.1细胞收获 正常人外周血淋巴细胞株，收获前12小时加人秋水仙素，终浓度为0.04pig/ml,1OOOrpm离心 10分钟收获细胞5（x106). 1.2.2破细胞，分离染色体 用75mmol/L氯化钾4℃低渗 10分钟后900rpm离心10分钟，沉淀重悬于0.5m1 分离缓冲液2（5mmol/LTris·HCI,pH7.5,0.75mol/Ll,6一己二醇；0.5mmol/LCCa2l; 1.Ommol/LMgCl,）中， 并置于37℃水浴 10分钟，接着置冰上30分钟．然后用7号注射器针头lOml注射器抽吸该悬液后适当用力推出 即可将中期染色体从细胞中释放出来，经低速离心弃去细胞核后，可直接用于梯度离心。 1.2.3蔗糖梯度离心 用50m1离心管．将65 蔗糖溶液用（分离缓冲液配制）作为垫底，5%^35%蔗糖从浓度高 至低逐层铺于其上，总量共约30m1，将制备好的染色体悬液3m1缓慢铺于最上层，用垂吊转头1IOOrpm离心90分 钟。由梯度最上层向下，每2ml收集一管，然后离心收集染色体，常规吉姆萨染色后普通光学显微镜观察并照相． 2结 果 与 讨 论 在蔗糖梯度中，细胞核沉到65 蔗糖垫底溶液中，染色体集团在其上，从梯度中部至近顶部，染色体基本按其 长短分层分布，在梯度的越下层，染色体越长，相似长度的染色体集中于一个层面。梯度的最上层基本为细胞质， 染色体极少。 ①本课题为国家自然科学基金资助项目内容之一，课题号 26 遗 传 HEREDITAS(Beijing)1997 19卷 一般流式细胞分类仪分类时，染色体悬液的流速为 1000条 ／秒，而某一条特殊染色体的流速约为20条 ／秒， 做一次酶切所需的染色体需要3--4个工作日才能收集到。如果要获得纯度较高的染色体，则分类时间还会延长． 解决这一问题的方法有二种，一种是对流式细胞分类仪本身的改进，该方法对多数实验室来说并不现实；另一种方 法就是采用预先富集技术，即利用差速离心、过滤和甘油或蔗糖梯度离心等方法富集所需染色体，以缩短分类时 间。这些富集技术可以使分类效率提高5倍． 国外有学者采用蔗糖梯度离心纯化中国仓鼠细胞染色体及大鼠肝脏细胞染色体 7〔)，用甘油梯度离心纯化 HeLaS3细胞染色体，但未见有将蔗糖或甘油梯度离心用于纯化正常人类染色体的报道．作者曾采用10%-40% 的蔗糖梯度、并以85 蔗糖溶液为垫底、1OOOrpm离心90分钟的方法来分离人类染色体。但染色体分离效果不 佳 多‘数染色体集中于离心管上部的一个区带内，细胞核不能离心至