Twist基因逆转录病毒载体的构建及其诱导正常乳腺上皮细胞发生上皮间质转化.pdfVIP

阳胞 |Jj分子免疫 杂忠(ChinJCellMtllmmuno1)2013，29(9) 905 · 论著 · 文章编号：1007—8738(2013)09—0905—05 Twist基因逆转录病毒载体的构建及其诱导正常乳腺上皮细胞发生上皮间 质转化 杨佳佳 ，胡 萍 ，周明莉 ，黄杰涛 ，柳满然 (重庆医科大学检验医学院，临床检验诊断学教育部重点实验室，重庆 400016) [摘 要] 目的 构建Twist基因逆转录病毒载体，研究其对人正常乳腺上皮细胞MCF10A的影响。方法 酶切 pcDNA3／myc— Twsit获得myc—wTist，克隆到逆转录病毒载体pBABE-puro中，构建重组质粒pBABE-myc—wTist。通过酶切、测序鉴定 Twsit基因 正确后 ，在体外将质粒pBABE-myc—wTSIt和其对照分别与包装质粒pAmpho共同转染人胚肾上皮细胞系293T细胞，进行逆转录 病毒的包装，并感染人正常乳腺 MCF10A上皮细胞 ，用嘌呤霉素(puromycin)筛选 ，获得成功转入wTSIt的MCF10A—wTsit细胞和 MCF10A-Vector对照细胞。通过 RT—PCR和Westernblot法验证Twist细胞在MCF10A-wTsit和MCF10A—Vector细胞内的表达。免 疫荧光技术和Westernblot法检测细胞 内上皮问质转化 (EMT)标志蛋白的表达。Transwell~法检测细胞的迁移和侵袭能力。 结果 重组逆转录病毒载体质粒 pBABE—myc—Twsit经酶切和测序鉴定构建正确 ；wTsit基因被逆转录病毒成功导入MCF10A细 胞，并在靶细胞内稳定表达 ，RT—PCR检测到 wTsitmRNA在MCF10A-Twist细胞中表达，Westernblot法检测发现myc—Twist蛋白 在 MCF10A—Twist细胞中表达；免疫荧光和Westernblot法检测显示在 MCF10A—Twist细胞中E—cadherin表达显著下调、vimentin 表达明显上调 ；与MCF10A-Vector细胞相比，Transwell~法检测发现MCF10A．Twist细胞迁移和侵袭能力明显增加 (P0．01)。 结论 Twist诱导MCF10A细胞发生EMT转化，并促进其迁移和侵袭。 [关键词]Twist；MCF10A正常乳腺上皮细胞；逆转录病毒 [中图分类号]Q782，R329．28，R737．9 [文献标志码]A Construction ofretroviralvectorcarryingTwistgeneanditsinductionofepithelial- mesenchymaltransition inhuman mammaryepithelial cells YANGJiajia，HUPing，ZHOUMingli，HUANGJietao，LIUManran CollegeofLaboratoryMedicine，KeyLaboratory ofLaboratoryMedicalDiagnostics，Ministry ofEducation，ChongqingMedicalUniversity， Chongqing400016，China 【AbstractJ 0bjective Toconstructaretroviralvectorcarrying s『fgeneandinvestigateitseffectonhumanmammary MCFIOA epithelialcells．M ethods Myc-Twistwasdigestedfrom pcDNA3／myc-TwistandsubclonedintotheretroviraIvector pBABE-purotoconstructarecombinantplasmid (pBABE—myc- f)．Theinse~ed fgenewasconfirmedbyrestriction enzymedigestionandDNAsequencing．TheplasmidpBABE-myc一7。 fandthepackagingplasmidpAmphowereco-trans- fectedintoHEK293Tcellsforpackagingofretrovirus．Mea