1骨髓间充质干细胞对猪心肌梗死治疗作用的实验研究.pdfVIP

晦京陕群大学硪士学僚论文 材料和方法 l实验靖辩 1．1实验动物 雄注苏申幼猪i2头，24，2±2．6芟g，随机分成对照缓(鹾Scs 组，n=6)和经非梗死相关动脉干细胞移植组(注入细胞培养液 缀，捉=5)，每经各5关(江苏瘩农辩貔提供)。 1．2仪器设备及试剂 基e矗孵型单光予发射计算机断层扫描枫 西门子公司 ””Tc—MIBI为江苏省原子医学研究所产品，放化纯度90％ 81 OR型离心机：德国公司 逢续可调微蚤移液管：上海求精生化试荆仪器有限公筒 分析天平：上海第二天乎仪器厂 嚣F Safe i200壁无菌屡流工诈台：上海力申议器公嗣 恒温孵育箱：美国Forma公司 X羚S—l嚣型藤差显微镜：重庆光学仪器厂 IMDM细胞培养基：sigma公司 姨蛋壹酶：烫毽GIBe0公蜀 胎牛血清：美国GIBcO公司 双抗(青霉索、链霉素)：sigma公司 BrdU(Bromodooxyuridine)：Sigma公司 鼠抗Brdu：武汉博士德公司 躐舂单克隆抗体：中山生物奢司 鸯京医科大学鞭卡学霞论文 V1I悃子：中山生物公司 磁￡～§抗俸：丹麦潞嚣0公司 2方法 2。l骨髓闲充质千细胞约分离、培莽及标记 1．肌注氯胺酮(15mg／kg)麻醉，碘伏消毒，用骨穿针在髂后上嵴穿 刺，有突破感后拔盎针心，蠲5越l舍50§u抽l野素趣圭理燕水2瓢l 注射器抽取10ml骨髓，摇匀后注入50ml的无菌离心管中，冰盒保存； 2，强含20u／艘l肝素的生理盐水与教驭的骨髓l：l等量混耋l，20姻rp疆 离心5min，弃去上清，落复3次； 3．抽取适量Fie01l(与抽取的骨髓量1：1)，将沉淀加入含20u／m1 肝索的生理热水至lOml，混匀，募缓缓加入Ficon上层，l500rpfIl 离心15min： 4。弃上清，糖取中层液体至离心管申，加入含20lj细l酐素麓生理盐 水l0ml，混匀，2000rpm离心5min，弃去上清，重复2次； 5。沉淀加入l麓凝完全培养液(含2§％髓牛血清，l§o睡gn青霉紊， 1 5％cO：孵育箱培养； 6．24小时麝换液： 7，待细胞密度达到60一70％左右对逃行传代培养； 8．细胞密度迭50％时，加入l0umol／L的Brdu过夜，进行标记： 9．移植前收集细胞，漂洗3次除去细胞培养液中的胎牛血清，悬浮 予《辩l I磁粼培养液中用于移植。 禽象莲器夫掌礞士掌馥楚文 2．2幼猪急帆心肌梗死模型建立 i。氯藤黧《15越，量疹辩注诱导麻醉，建立耳缘静簿透露，给予3嚣茂 巳比妥钠(1 Omg／kg)与芬太尼复合麻醉； 2。气管稔案，哮援氟鞲璐呼唆，瀚气羹焉13一j妊{，囊蚕呼吸出毒l： 2，并且间晰追加3％戊融比妥钠，同时利多卡阁经脉滴注； 3，臻醉轰爨盛摇记；心龟瀵，嚣心恕盛护，拳嚣参皮，常熄港毒，懿 无菌洞巾；猪仰卧位，行胸骨正申忉口，逐腾切开皮肤，皮下组织， 躲落，劈嚣麓黄，显露心菠，窘嚣。心包并悬警； 4．于冠状动脉前降支中下1／3处，第二对角支分出处以下分离冠状 蛰媾，著吝姥跫籍氧，蟪强菪可观察翻囊美绥血基凌囊惫楚跨，薅熟 减弱，心电脑护可见ST段抬高； S。缝合心包，清狳簿羧鑫象盘，鼹察手誊撬鼙褒元活番潍篷盘轰美 闲胸腔，逐艨缝合胸骨，肌层，皮下组织及皮肤； 2。3旁夔聪悫璞手舞稳移植 心肌梗地模型建巍詹4周行瞥髓问充磁平细胞移槭；氯胺酮 《iS键7襄疹戢注羲导l窳醛，霆立耳缘营臻道路，给予戌＆彝二妥镳 (10mg／kg)静脉麻醉；切开皮肤，分离出右侧股动脉，鬣入7F动脉 糍管，动脉注入歼素5000玎，行左右冠状动脉造影；骨髓蚓充庋干细 胞移植组漶澎成绣詹，嚣入导丝及球囊，于瘩蕊状套脉或嚼旋支注入 骨髓间充鹰予细胞(4m1)；对照组以闽样的方法注入相同蚤的IMDM培 养液鞲委{)。缝来君攘鑫动脉赣，炼籀爱餐髂，缝台{露蹬，送蚤瓣务 鸯哀医科太学囝i卡学位论文 继续饲养。 2．4侧支循环评价(冠状动脉造影) 心肌梗