丹参酮类化合物生物合成相关酶基因克隆及功能研究.docVIP

附件2 论文中英文摘要 作者姓名：高伟 论文题目：丹参酮类化合物生物合成相关酶基因克隆及功能研究 作者简介：高伟，男，1979年05月出生，2005年09月师从于中国中医科学院黄璐琦研究员及中国医学科学院药物研究所程克棣教授，于2008年06月获博士学位。 中 文 摘 要 中药丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根和根茎，是我国常用的中药之一。丹参药用历史悠久，始载于《神农本草经》，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦之功效。丹参中脂溶性有效成分主要为丹参酮类化合物，是一类具有邻醌或对醌母核结构的二萜醌类化合物；药理研究表明具有心血管活性、抗肿瘤活性以及肝损伤保护等生物活性，为丹参治疗心脑血管疾病、感染性疾病、抗肿瘤和糖尿病等的物质基础。 丹参酮类化合物是丹参植物中二萜类次生代谢产物。目前，对丹参酮类化合物次生代谢途径的研究属于起始阶段，特别是GGPP下游生物合成途径的研究尚属空白；从丹参植物中克隆与丹参酮类次生代谢产物生物合成相关的基因，并进行功能鉴定与研究，是丹参酮类有效成分生物合成途径及其生成机理研究的基础，这将为阐释丹参药材品质的形成、分子育种提供科学依据，也为提高丹参酮类成分含量或直接生产有效成分或中间体提供了方法和技术。 基于以上认识，本论文针对前期芯片杂交获得的基因片段开展了如下工作： 1 丹参“柯巴基焦磷酸合酶”全长cDNA的克隆及其分析 本研究采用快速cDNA末端扩增（RACE）克隆得到丹参柯巴基焦磷酸合酶（Salvia miltiorrhiza copalyl diphosphate synthase，SmCPS）全长基因；对SmCPS完整开放阅读框、编码蛋白的特性及氨基酸序列的多重序列比对、系统发生树等进行分析。结果表明从丹参中克隆得到长为2688 bp的SmCPS全长cDNA序列，包含了一个2382 bp核苷酸的完整开放阅读框，编码793个氨基酸的蛋白，预测蛋白的分子量为90.362 KDa，等电点为6.45；多重序列比对发现，SmCPS氨基酸序列与其他植物来源的CPS相似，其氨基酸序列N端含有“DXDD”基序的结构功能域，说明可能在金属二价离子（Mg2+或Mn2+）的辅助下，具有起始环化GGPP的功能；另外，SmCPS核苷酸的系统发生树的聚类分析说明从双子叶植物丹参中克隆的SmCPS与已知单子叶植物中参与赤霉素途径的CPS遗传距离较远，与其它已知双子叶植物中的CPS接近，但不完全等同它们的催化功能，推测为起始环化GGPP参与赤霉素或（和）其它二萜类次生代谢产物的生物合成的二萜合酶。采用定量PCR检测丹参中SmCPS mRNA，结合丹参酮类成分的含量测定，对SmCPS进行表达分析。表达结果的进一步分析表明丹参酮类成分的积累随着SmCPS mRNA表达水平的提高而增加，提示SmCPS可能参与了二萜次生代谢产物丹参酮类成分的生物合成。 2 丹参“类贝壳杉烯合酶”全长cDNA克隆及其分析 本研究采用RACE克隆得到丹参类贝壳杉烯合酶（Salvia miltiorrhiza kaunene synthase，SmKSL）全长基因；对SmKSL完整开放阅读框、编码蛋白的特性及氨基酸序列的多重序列比对、系统发生树等进行分析。结果表明从丹参中克隆得到长2110 bp的SmKSL全长cDNA序列，包含了一个1788bp核苷酸的完整开放阅读框，编码595个氨基酸的蛋白，预测成熟蛋白的分子量（MW）为68.326 KDa，等电点为6.00；多重序列比对发现SmKSL氨基酸序列C端含有“DDXXD”基序的结构功能域，说明可能在金属二价离子（Mg2+）的辅助下起始磷酸离子化而具环化底物的功能，形成特异的多环二萜烯类产物；另外，SmKSL核苷酸的系统发生树分析表明从中克隆得到的SmKSL与暂未得到功能验证的烟草萜类环化酶最为接近，SmKSL与已知的同为双子叶植物的KS序列形成两个明显的类群，而在与已知裸子植物中二萜合酶氨基酸序列聚为一大类，提示SmKSL与裸子植物冷杉属中的萜类合酶可能在功能上有一定的相似性。采用定量PCR检测丹参中SmKSL mRNA，结合丹参酮类成分的含量测定，对SmKSL进行表达分析；表达结果进一步分析表明丹参酮类成分的积累随着SmKSL mRNA表达水平的提高而增加，提示SmKSL可能参与了二萜次生代谢产物丹参酮类成分的生物合成。 3 丹参“柯巴基焦磷酸合酶”原核表达、纯化及功能鉴定 将丹参中克隆得到的SmCPS全长基因的完整开放阅读框插入到原核表达载体pET32a(+)的EcoRⅤ和NotⅠ酶切位点之间，构建带有HIS表达标签的SmCPS重组表达载体pET32CPS；转入E.coli BL21trxB(DE3) 表达宿主菌采用IPTG诱导表达，并对影