第十六章基因诊断第十七章基因治疗.ppt

基因诊断 基因改变与疾病 基因突变导致疾病: 遗传病, 肿瘤 外源病原体基因导致疾病: 肝炎, HIV病毒 基因异常表达 : 肿瘤等疾病 基因缺失导致: 遗传病,肿瘤 基因重排: 肿瘤, 白血病 这是目前 疾病基因诊断的分子基础 基因诊断 采用分子生物学方法，在 DNA 或 RNA 水平上对某一或某些基因进行分析，从而对特定疾病作出诊断。 基因诊断的特点 针对病因：直接了解致病因素，有利于作出明确判断。 预见性：在个体未发病时发现致病的潜在因素。确定胎儿是否携带致病基因、确定个体的易感性、发现潜伏感染等。 适应性：诊断范围广，对待测样品无组织来源的要求。 一、基因诊断的基本原理和方法 探测基因的改变，包括内源性基因改变与外源性基因引入。 直接的基因突变检测： 在明确特定基因突变与疾病直接的因果关系，对其分子机制有一定的了解时可以应用。 间接的基因连锁分析： 利用未知或难以检测的致病基因与特定已知序列间的连锁关系，确认受检者是否携带致病基因。 外源性基因的检测： 主要用于感染性疾病或寄生虫等的检测。 （一）基因突变的诊断 基因突变检测的范围包括： 基因的点突变。 小片段的缺失或插入。 大片段的缺失或插入。 基因的易位、倒位、重排等。 检测的主要方法： PCR 与核酸杂交。 1.点突变或小片段基因改变的检测 基因的改变不造成基因长度的变化，或变化难以检测。 在基因改变伴随有限制性内切酶识别位点改变时检测较为简便，可用限制性酶谱分析。 家族性帕金森病的致病基因α-synuclein 发生点突变 G209A，导致产生 Tsp45I 酶切位点。 等位基因特异性寡核苷酸探针杂交 等位基因特异性寡核苷酸（ASO）：设计针对正常和突变序列的探针，通过 PCR 技术扩增待测基因，在严格的杂交条件下分别进行杂交。 主要应用于固定位点的固定突变类型的检测。 SSCP 单链构象多态性（Single Strand Conformation Polymorphism):长度相同而构象不同的单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中表现出不同的迁移率，称为SSCP。 相同长度的DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同。 PCR-SSCP 单链构象多态性是基于DNA构象差别检测点突变的方法。在无法确定突变部位与突变类型时可以采用。 在 PCR 扩增片段长度小于 200 bp 时，90％ 的突变可以被检测出来。 直接序列测定 直接确定突变位置与类型的唯一方法。一般在完成其他检测方法后可通过测序进行鉴定。 PCR 产物可直接用于测序。 PCR-SSCP-Sequencing 2. 大片段基因改变的检测 大片段的基因改变可以影响到基因的长度，相对易于检测。 传统的检测方法：基因组 DNA 经酶切后通过 Southern 杂交方法检测。 直接的 PCR 扩增可简化检测过程。 多重PCR：杜氏肌营养不良的检测 DMD：Duchene muscular dystrophy。 X-染色体连锁，男婴发病率为 1/3500。 主要特征为横纹肌萎缩，患者在 5 岁发病，12 岁丧失行走能力，20 岁左右因呼吸衰竭而死亡。 由 dystrophin (抗肌萎缩蛋白) 缺陷造成。 杜氏肌营养不良的检测 Dystrophin 基因跨度 2.4Mb，包含 79 个外显子，是人类最庞大的基因之一。 约 60％ 的患者 dystrophin 基因发生了不同程度的缺失。 多重 PCR 方法：同时扩增多个外显子。 3、基因重排的诊断 在已知重排基因和重排位点的情况下，设计3条PCR引物进行PCR扩增。 （二）多态性分析 限制性片段长度多态性：RFLP DNA重复序列多态性：VNTR，STR 1、限制性片段长度多态性 利用限制性内切酶切割不同个体基因组 DNA 时，所获得的酶切片段数目和长度存在差别的现象称限制性片段长度多态性。 限制性内切酶酶切位点的有无，产生片段数目差别。 切点间发生插入或缺失，导致长度变化。 检测方法可采用酶切结合 Southern 或 PCR 结合酶切。 RFLP 当DNA分子上发生突变、重排、核苷酸的插入或缺失时可导致限制性酶切位点的增加、缺失或位置改变，用限制性内切酶消化待测DNA和野生型对照DNA，通过比较两者酶切片段的长度、数量上的差异就可确定DNA的突变情况。 PCR-RFLP Lener遗传性视神经病： RFLP连锁分析 当某种 RFLP 与致病基因高度连锁，且连锁关系存在于一定人群时可以采用。 正常西非人群β珠蛋白位于 HpaI 酶切 7.6 kb 片段，镰刀型贫血人群则出现 13.0 kb 片段。 2、 VNTR 与 STR 可变数目串联重复 (variable number of tandem repe