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第二节重组DNA技术.ppt
一、重组DNA技术相关概念 应用酶学的方法, 在体外将各种来源的遗传物质DNA与载体DNA接合成具有自我复制能力的DNA分子，再通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，经扩增提取获得大量同一DNA分子。 载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具， （1）能够自我复制，并带动插入的外源基因一起复制 （2）具有合适的限制性酶切位点 （3）具有合适的筛选标记 （4）细胞内拷贝数要多 （5）细胞内稳定性高 目前最常用的载体包括细菌质粒、l噬菌体、cosmid质粒等。 质粒载体 的一般结构 DNA克隆常用载体 思考题 蓝白筛选是基因克隆中经常使用的方法，但是有的时候会出现一些假阳性的结果，你们觉得还有其他的验证方法吗？ * 重组DNA操作一般步骤： 分：分离目的基因 接：目的基因与载体连接 转：重组DNA转入受体菌 筛：筛选出合适的受菌体 获得需要的目的基因常用的方法： （1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库(genomic DNA library)，从中调用目的基因； （2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立cDNA文库； （3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。 （4）化学合成 1.分------分离目的基因 2. 接-------目的基因与载体连接 制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞； 3. 转-------重组DNA转入受体菌 大肠杆菌 酵母 昆虫细胞 哺乳动物细胞 4. 筛-------筛选出合适的受菌体 质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆。 否则形成蓝色克隆。 小 结 目的基因获取 载体质粒提取 重组质粒构建 宿主菌感受态细胞制备 感受态细胞的DNA转化 菌体培养，重组子的筛选 *
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