新生山羊小肠上皮细胞株的建立和鉴定.pdfVIP

2007年 第43瓣 筑 {骖瀚 ReproductionandPhysiology · 簇 鹱 遴 新生山羊小肠上皮细胞株的建立和鉴定 匡 伟，王海霞，邵桃玉，赵国琦 (扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009) 摘 要：进行肠上皮细胞的分离培养是研究小肠功能、营养物质吸收机制及其调控的主要手段之一。本试验利用 组织块培养法成功的建立了山羊小肠上皮细胞株。获得的上皮细胞具有较强的增殖能力，24h内贴壁并发生分 裂。纯化后按照0．8～0，9X10个 ／cm2的密度种植时，3～4d连成一片。倒置显微镜下观察培养细胞为多角状或卵 圆形，单层生长不重叠，呈铺路石状排列，细胞角蛋白鉴定为阳性。采用组织块培养法可以获得具有增殖能力的山 羊小肠上皮细胞，为研究IEC的生理病理等提供有用的实验模型。 关键词：小肠上皮细胞 ；组织块培养 ；山羊 中图分类号：$827．1 文献标识码：A 文章编号：0258—7033(2007)19—0011-04 动物细胞和组织培养已被广泛运用于细胞和分子 11．3 培养用液 DMEM培养基 ：添加 10％的胎牛血 生物学领域。其中，更多的应用于细胞分化机制的研 清、5~g／mL胰岛素、10ng／mLEGF、100U／mL青霉素、 究。就上皮细胞而言，各种分离培养技术成为深入研究 100 mL链霉素。蔗糖一EDTA缓冲溶液 ：0．45mol／mL 小肠功能、病理和分化的重要工具rI1。国外学者对肠上 蔗糖 ，0．36％EDTA，0．1％牛血清蛋 白溶于PBS中，pH 皮细胞研究较多，但是分离方法各有不同，多采用酶消 7．4。 化法 ，且多局限于小鼠、大鼠和人，对于反刍动物的肠 1．1．4 培养器具 超净工作台(vs一1300U)，二氧化碳 上皮细胞研究甚少。国外已有学者成功建立 了多种小 培养箱(SHEL)，倒置显微镜(OLYMPusCKX41)，冷冻 肠上皮细胞系，如 IEC一62】、IEC～18c3J等，而国内尚无小 离心机(EPPENDORF)，电热恒温水槽 (HHW一21CU)， 肠上皮细胞连续传代并成功建系的报道。本文使用组 多孔培养板、培养皿和培养瓶(SUMILON)。培养瓶使 织块培养法成功的建立 了山羊小肠上皮细胞株，为构 用 鼠尾胶原包被，培养箱中过夜，紫外线灭菌并用PBS 建山羊小肠上皮细胞库提供了基础依据。 冲洗。 1．2 小肠上皮细胞的分离 ①无菌条件下用PBS清 1 材料和方法 洗小肠数次，剔除肠系膜 ，冲洗肠管。用眼科剪刀纵向 1．1 实验材料 剖开肠管，分别用PBS和无血清的DMEM清洗数次。 1．1．1 组织来源 刚出生的徐淮 白山羊羔羊，无菌条 清洗液中的抗生素为培养液中的2～3倍 ；②将肠管剪 件下取出十二指肠 ，剔除肠系膜 ，放置在无血清的 成1mm3的碎片，在转移至50mL的离心管中加无血 DMEM培养基中冰浴保存，备用。 清 DMEM清洗 ，用移液管反复吹打，1000r／mir离心7 1．1．2 试剂和药品 DMEM培养基为Gibco公司产 min；③如上反复清洗组织块，直至上清液澄清 ；④用 品；表皮生长因子 (epidermalgrowthfactor，EGF)，胰岛 10％FCS—DMEM悬浮组织块并取适量种植于培养皿 素，0．04％的胰蛋 白酶均为Sigma公司产品；青链霉素， 或培养瓶中。⑤培养 24h后换液，继续培养。 蔗糖为Amresco产品；胎牛血清(FCS)为杭州四季青产 1．3 小肠上皮细胞的纯化 刮除法4[1：将培养瓶皿放 品，细胞角蛋白1