3.24小鼠E-selectin%2f人IgG嵌合蛋白在COS-7细胞中表达纯化与鉴定.pdfVIP

小鼠E-seIectin／人IgG嵌合蛋白在00S-7细胞中 的表达纯化与鉴定 硕士研究生：刘纯 指导老师：张嘉宁 教授 专业名称：生物化学与分子生物学 摘 要 细胞表面的粘附分子介导细胞与细胞、细胞与细胞间质问的相互 作用。选择蛋白(selec七；n)是粘附分子家族中非常重要的成员。E一 选择蛋白(E—seIectin)在炎症早期，调节循环白细胞与血管内皮细 L-1 B(I 胞间的相互作用。当受到炎性介质白细胞介素-1 B)、肿瘤 坏死因子a(TNFⅡ)、内毒素等的刺激后，内皮细胞表面会表达E一选 S(X)、唾液 择蛋白。E一选择蛋白与其寡糖基配体如，唾液酸化的Lewi 酸化的Lewi S(a)结合，引起白细胞沿着血管壁滚动，进而穿越觑管壁 向炎症部位移动。E一选择蛋白不仅在急性炎症的早期阶段，而且在缺 血再灌注损伤、动脉粥样硬化、肿瘤转移等发病机制中均有重要作用。 因此，通过阻断E一选择蛋白与其糖基配体的结合，有可能对炎症及肿 瘤转移起到一定的抑制作用。 Fc段嵌合基 本文的目的是将小鼠E一选择蛋白胞外功能区与人lgG I i ectn／l 因连接到构建成的E—Se gG嵌合蛋白表达载体，在真核瞬时表 达载体COS-7细胞中表达，并纯化、鉴定表达产物．以为研究进一步E一 选择蛋白的功能提供纯化的有生物活性的蛋白。 I ecti n／l 方法E-se gG重组表达载体通过氯化钙法转化大肠杆菌 HBIO／P3并扩增，利用去内毒素质粒纯化试剂盒提取重组质粒：PCR鉴 i I ectn／I 定后，将E-se gG重组表达载体转染COS一7细胞．EL|sA检测 n 细胞培养上清中嵌合蛋白的表达：ProtejA亲和层析纯 ·1’ 结果O．8％琼脂糖电泳显示所提质粒主要为超螺旋结构；PCR结果 显示得到342bp清晰单一条带，片段大小与预期一致。EL}sA法证明在 A亲和层析纯化后，SDS—PAGE E-seIectin／lgG嵌合蛋白：经Protein 印迹分析显示该蛋白既能与抗小鼠E一选择蛋白抗体特异结合，又能与 抗人IgG的多克隆抗体特异结合：该纯化蛋白在体外黏附HL一60细胞(细 胞表面有E一选择蛋白寡糖配体sLewisX)细胞数值明显高于B16细胞(细 胞表面无E一选择蛋白寡糖配体sLewisX)的细胞数，也明显高于 l L-seecti n／l gG黏附HL-60细胞的细胞数。 gG嵌合蛋白或人I l ect i n／l 上述结果表明：通过E—se gG重组表达载体在哺乳动物 n COS一7细胞表达、并且经过ProtelA亲和层析纯化，得到了有生物学 活性的重组E-seIectin／IgG嵌合蛋白。 关键词： E-选择蛋白 嵌合蛋白