小鼠抗人细胞色素P450 1A2合成肽抗血清的制备与鉴定_医学论文.doc免费

小鼠抗人细胞色素P450 1A2合成肽抗血清的制备与鉴定_医学论文 小鼠抗人细胞色素P450 1A2合成肽抗血清的制备与鉴定_医学论文 作者：武正华, 唐晓波 王志刚 纪宏宇 赵振营 朱大岭 【关键词】 CYP1A2,合成肽,抗体,小鼠 　　[摘 要] 目的: 制备小鼠抗人细胞色素P450 1A2 （CYP1A2）抗体及其特性鉴定。方法: 利用生物信息学方法分析CYP1A2蛋白的序列, 根据4个指标（亲水性、 柔韧性、 抗原性及表面性）选择欲合成的多肽序列, 设计、 合成CYP1A2多肽。将其与载体蛋白钥孔戚血蓝素（keyhole limpet hemocyanin, KLH）偶联, 免疫BALB/c雌性小鼠制备抗CYP1A2抗体。用间接ELISA法测定抗体的效价, Western blot鉴定其特异性。结果: 成功地获得针对小分子CYP1A2的抗体。该抗体效价为1∶16000, 可与CYP1A2合成肽及天然CYP1A2出现特异性反应。Western blot的结果显示, 该抗体识别的相应抗原的相对分子质量（Mr）为58000。结论: 合成的多肽KLH复合物具有免疫原性, 可用于制备相应的抗体。制备的小鼠抗CYP1A2合成肽抗体的效价高及特异性良好。 　　[关键词]CYP1A2 合成肽 抗体 小鼠 　　CYP1A2和CYP1A1是CYP1A亚家族中仅有的两个成员[1], 它们在人体中的表达各有其组织特异性, CYP1A2主要在肝脏表达[2], 也有在脑组织中检出CYP1A2 mRNA而无蛋白表达的报道[3]。由于CYP1A2将某些杂环芳香族前致癌物激活代谢成致癌物, 例如CYP1A2催化的食物烹调过程中产生的2氨基1甲基6苯基亚氨基[4, 5b]吡啶的N2羟基化激活反应, 在化学致癌中起着非常重要的作用[4], 因此, 研制CYP1A2抗体将对CYP1A2功能的研究以及抗癌药的研制、 开发具有重要的理论意义和临床价值。本研究中研制小鼠抗CYP1A2的抗体并进行了部分特性鉴定, 为后续的研究工作奠定了基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 福氏佐剂及3,3,5,5四甲基联苯胺（TMB）均购自Sigma公司。HRP山羊抗小鼠IgG购自Jackson Immuno Research公司。牛血清白蛋白（BSA）购自Solarbio公司。硝酸纤维素膜购自BIORAD公司。ECL Plus购自Amersham Biosciences公司。其他试剂均为国产分析纯。电动玻璃匀浆机（DY891型）为宁波新芝生物科技股份有限公司产品。酶标仪（MK3）为Thermo公司产品。电泳槽（DYCZ24D型）、 电泳仪（DYY6B型）均为BIORAD公司产品。多肽合成及其与KLH、 BSA的联接由北京中科亚光生物有限公司完成。6周龄BALB/c雌性小鼠, 由哈尔滨医科大学动物中心提供。正常人肝脏组织, 由“人类肝脏蛋白质组计划”项目提供。 　　1.2 方法 　　1.2.1 CYP1A2抗原表位的分析 由SWISS PROT网站获知CYP1A2蛋白的序列, 然后利用DNAStar软件分析其序列的特点, 根据对其亲水性（hydrophilicity）、 柔韧性(flexibility)、 抗原性(antigenicity)及表面性(surface property)4个参数预测的结果, 确定351～365位15个氨基酸作为欲合成的多肽序列: GRERRPRLSDRPQLP。 　　1.2.2 CYP1A2多肽的合成及其与KLH和BSA的交联 CYP1A2多肽由北京中科亚光生物有限公司采用多肽自动合成仪合成 CYP1A2与KLH和BSA的交联采用戊二醛连接法[5], 将5 mg合成多肽分别加入7 mg KLH和BSA中, 边振荡边缓慢加入新鲜配制的3 g/L的戊二醛溶液(1 mL), 室温作用2 h。以pH8.5硼酸缓冲液透析过夜。交联形成CYP1A2KLH、 CYP1A2BSA偶联物。 　　1.2.3 小鼠抗CYP1A2多肽抗体的制备[6] 取0.5 mg多肽KLH偶联物加250 μL的去离子水与等量的完全福氏佐剂充分乳化后, 于小鼠（2只）背部注射两点,每点约20 μg, 剩余的腹腔注射。3周后加强免疫, 剂量同前, 用不完全福氏佐剂充分乳化后, 注射于小鼠腹腔 以后隔两周加强1次 从第3次加强免疫开始, 每次免疫后7 d, 经尾静脉采血测定抗体的效价, 符合要求时, 用不加佐剂的多肽KLH腹腔注射再加强免疫1次, 3 d后取血, 分离血清后, 无菌分装保存于-80℃备用。 　　1.2.4 人肝脏微粒体蛋白制备 取10 g正常人的肝脏、 剪碎, 用磷酸钾盐缓冲液反复冲洗除去血红蛋白后, 加入上述磷酸钾盐缓冲液制成肝匀浆。然后将肝匀浆依次于4℃以100