含RGD短肽的类蚕丝蛋白的制备和细胞相容性研究.pdfVIP

箩六届长三考影式脊攒雳窍分静坛论文 含RGD短肽的类蚕丝蛋白的制备及细胞 相容性研究 浙江理工大学材料与纺织学院教育部先进纺织材料与制备技术重点实验室张艳红王明启姚菊明 浙江大学动物科学学院应用生物资源研究所张艳红蔡玉荣 【摘要】利用基因工程方法将含有短肽RGD的氨基酸序列连接到桑蚕丝素蛋白的非晶序列 AGVGAS]。 类蚕丝silk-KGD蛋白可以在生物材料领域得到应用。 【关键词】蚕丝蛋白；基因重组；KGD；细胞粘附；细胞增殖 丝素蛋白是由蚕茧缫丝脱胶而得的纤维状蛋白质，约占天然蚕丝蛋白的70％一80％，是一种含 18种氨基酸的天然高分子纤维蛋白，主要由甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成。这些氨基酸残基构成了 丝素蛋白的结晶区，约占结晶区总组成的85％…，其中，GAG^GS为结晶区中高度重复序列，为蚕丝 蛋白提供了良好的热稳定性和机械性能晗1；而带有较大侧基的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等主要存 在于非结晶区，主要序列为GAGYGYGAGVGA等。结晶区与非结晶区交替分布，其中的肽链沿着纤维外 形的延伸方向排列。 丝素的主要构成是甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，极易形成反平行的B一折叠片层结构，因而丝素蛋 白纤维具有良好的热稳定性和机械性能。丝纤维最早作为手术缝合线用于生物医学研究中Ⅲ，近年 研究发现，丝素蛋白作为生物材料有以下优点H1：机械特性好。能与许多高性能的纤维媲美：易加 工：表面易化学共价修饰粘附位点：可通过遗传工程改造丝蛋白成分来调节相对分子质量的大小、 可结晶性和可溶性；在体内外降解速率缓慢，降解产物不仅对组织无毒副作用，还对周围组织有营 养与修复作用。由于以上特点，使丝素蛋白在生物医学领域得到了广泛的应用研究和重视。目前丝 素蛋白已用作药物控制释放材料陆一1，可制作成人造皮肤眈引、人造韧带凹1及血管n们等。 作为一种生物材料，为进一步提高高分子材料与细胞之间的粘附性能，在高分子材料表面固定 RGD成为提高材料细胞粘附性能的有效手段n¨。本文利用基因工程方法将含短肽RGD的氨基酸序列连 coli(E cold转基因系统将其合成 蚕丝素-RGD融合蛋白(简称silk—RGD)，并利用Escherich／a 并表达出来，以期获得具有优异物理性能和生物相容性的高分子材料。 1实验材料与方法 1．1实验材料 合成；琼脂糖，蛋白胨，酵母粉。琼脂粉，IPTG，三(羟甲基)氨基甲烷，B一巯基乙醇，咪唑，溴酚 蓝，过硫酸铵等也购自该公司；卡那霉素，氨苄青霉素，溴化乙锭购自上海生工(进口分装)；质粒 coli阴5 HindIII pET-30a(+)，pUCll8，菌株E PlasmidPutification GelDNA 等限制性内切酶，DNAMarker及蛋白Marker，MiniBESTKit，Agorose PurificationKit均购自大连宝生物有限公司；其他试剂均为分析纯，购自杭州汇普化工有限公司。 一98— 箩六石长五孝影式给并雳窍争势攒静文 1．2实验方法 l-2．1 lk-RGD表达载体的构建 pET30a(+)／si 将设计的silk-RGD基因序列，委托大连宝生物有限公司进行人工合成，获得插入目的基因的 I和NheI双酶切位点，所以将质粒进行Spe pMDl8-T-simple载体。由于设计silk-RGD时两端带有Spe I和NheI双酶切后可以得到silk-RGD蛋白的单体核苷酸序列。然后将该序列与经过双酶切的 GelDNA 经酶切验证后，将正确连接的单克隆选出，Agorose Putifica