RNA稳定剂在显微切割抽提组织总RNA中的应用.pdfVIP

维普资讯 · 62 · JDiagPathol，February2005，Vo1．12，No．1 RNA稳定剂在显微切割抽提组织总RNA中的应用 范松青，罗 鑫，刘淑华 (中南大学湘雅二医院病理科，长沙 410011) [关键词】 RNA稳定剂； 显微切割 ；抽提组织总RNA [中图分类号】 R394．33 [文献标识码】 A [文章编号】1007—8096(2005)O1—0062—02 随着人类基因组计划的完成以及 cDNA微阵列等高通 置 10min：10000r／rain4℃离心 10min，吸取上清液于另一试 量技术的飞速发展，对特定组织细胞基因表达谱的研究，必 管，加入等体积 的异丙醇，一20℃放置 30min。10000r／min 需获取相应组织细胞的RNA，显微切割为获取特定 RNA提 4℃离心 15min，去上清液，70％乙醇洗涤沉淀，室温风干，加 供了可靠的工具 ’。不同于常规 RNA抽提技术，显微切割 入 l5 DEPC处理的双蒸水溶解。紫外分光光度计测定 需经过冷冻切片、HE染色和显微镜下切割等众多在常温下 RNA浓度和纯度。凝胶电泳检测 RNA的质量。DNase—I消 操作的步骤 ，容易引起 RNA降解。本研究 旨在探讨显微切 化 RNA中痕量 DNA：反应体积50l，RNA10 l，DNase．I5u， 割时防止 RNA降解的最佳方法。 RNasin100U，10×PCR Buffer5 l，25mmol／LM[gc 18 ，37~(2 lh，等体积苯酚：氯仿(1：1)抽提，乙醇沉淀，RNA溶于 l0 1 材料与方法 DEPC处理的水中。经 PCR扩增检测 GADPH，无特异扩增条 1．1 材料 外科手术切除的肠癌、食管癌和乳腺癌标本各 带出现以保证 DNA消化完全。RNA反转录为 cDNA，反应体 l0例。RNAlaterRNAStabifizationReagent为 QIGENE公司产 积20l，模板 RNA2 g，反应结束后，98℃5min终止反应。 品，TRtZOLr试剂购 自美国GIBCOL／BRL公司。 50 PCR反应体系采用下列参数进行：94℃5min，94~(250s， 1．2 方法 从手术切除的肿瘤标本中取 2份大小为2cm× 55℃50s．72℃ lmin，28个循环。1．5％琼脂糖凝胶电泳，紫 2cm×0．2cm的肿瘤组织．其中l份标本按试剂说明书操作 外线灯下照相。 方法浸入RNAlaterRNAStabilizationReagent中，然后放入4℃ 冰箱中固定过夜；另l份组织入液氮中保存。两种方法处理 2 结果 的组织均用 OCT包埋，恒温冷冻切片机(一25℃)连续切片 分光光度计检测RNA稳定剂处理组织与常规未处理组 30张，切片厚 l2～15*／m，贴于经硫酸浸泡处理 、DEPC水洗、 织的RNA浓度，结果见表 l。RNA稳定剂处理组织 ．显微切 高温烤干的玻璃切片上；70％乙醇固定 10min，DEPC水洗2 割后抽提的RNA浓度明显高于对照组，凝胶电泳结果见图 ×3min：苏木精染色2min，DEPC水洗2×3min；伊红染 20s， l～3，与常规冷冻切片显微切割抽提的RNA相比，稳定剂处 95％和100％乙醇洗涤，切片保存于100％乙醇中直至光学显 理组织的RNA28S、18S条带的亮度 明显高于5s，