基因敲除技术及应用.pdfVIP

北京大学基础学院药理学系 谭焕然 写在课前的话 基因敲除动物相对于转基因动物技术有所进步，可以研究基因的功能，并创立或者建立一些 动物模型，可以通过这些研究发现疾病的发生、发展过程，发生的机制，可以寻找有效的治疗方 案。 一、基因敲除或基因剔除模型动物的制备方法 主要有随机敲除动物、定位敲除动物、条件基因敲除动物、基因诱变技术（ ENU 技术）、 RNAi 技 术，这些方法都可以用于制备基因敲除动物模型。 做基因敲除动物的程序首先是要寻找目的基因，然后构建重组基因载体，把重组的 DNA ，转入受体 细胞。选择培养基筛选已击中的 ES 细胞，然后把筛选好的 ES 细胞转到胚胎中，然后做各种各样的形态 学观察及分子生物学检测。 上图是筛选基因的模式图，用 PCR 方法得到基因，先将其剪切成线性，之后加上 PCR 目的基因，重 组后得到完整的基因，然后进行繁殖。主要靠 PCR方法扩增，速度是很慢。用细菌繁殖的方法极大的加快 了速度。 常用的选择性标记基因分为正选择和负选择两类，它们使用的药物都有哪 1 些不同呢？ 上图是常用选择性的标记基因。一个是正选择的，如新霉素基因、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶；负选择 的有 GPT （黄嘌呤、鸟嘌呤磷酸转移酶）；还有既是正选择又是负选择的。正负选择都是基因，但是选 择的药物不一样，基因的表达也不同。 2 可以在某一个脏器敲除，也可以做时间敲除。根据发育发展的过程，可以在某一个阶段把其基因敲除 掉。上图是 Cre-loxP 的原理，黑的三角在左敲除，中间是代表两个 loxP 之间的一段基因，要做的时 候，先要把 loxP 插进要敲掉的基因两侧，插进去以后在 Cre 存在的情况下，基因就能敲除掉。 如果 loxP 顺向排列，中间的基因会敲掉，如果 loxP 对排，基因是在里面，因为 Cre的存在又翻回 来，所以它就在里面翻转。 有两个基因在两条染色体上，想把这个基因放进去，就把这两条染色体转进去，这是 Cre 方法。现 在要敲除基因，但是不在 ES 细胞水平操作，只是把 loxp 放进去，让其在 ES 细胞里表达，然后发育成 小鼠，这个小鼠便具有 loxP 。如肝脏特异表达 Cre ，或者胰腺特异表达 Cre ，然后在胰腺发育的过程 中， Cre 、loxP 中间的这段基因会丢掉。所以这就是空间上的敲除， loxP 放入不同脏器，如注射到 EX 细胞、受精卵，然后在机体发育过程中，所有的细胞都带有标志，但是如果没有 Cre ，并不影响上、 下游基因的表达。 上图是做基因敲除鼠的流程图。 3 二、经典的基因剔除方法的不足 经典基因剔除方法的不足主要有：重要功能基因的缺失可以造成胚胎的死亡，如果基因对于个体发育 的过程中非常重要，可能造成小鼠的死亡；还有，剔除了所有组织的基因，如果基因是组织特异表达的， 这种缺失会造成组织特定功能的不稳定。 经典的基因剔除方法的不足（ ）。 A. 重要功能基因的缺失可以 造成胚胎的死亡 B. 剔除了所有组织的基因， 如果基因是组织特异表达的， 这种缺失就会造成组织特定功 能的不稳定 C. 以上都是 D. 以上都不是 正确答案：C 解析：经典的基因剔除方法的不足主要有：重要功能基因的缺失可以造成胚胎的死亡，如 果该基因对于个体发育的过程中非常重要，可能造成小鼠的死亡；还有就是剔除了所有组织的 基因，如果基因是组织特异表达的，这种缺失会造成组织特定功能的不稳定。 基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。指外源DNA与 受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基 因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。此法可产生精 确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。