草珊瑚与金粟兰叶片双位点特异性PCR鉴别方法研究.pdfVIP

第39卷第 l7期 中圈中药杂志 VSo1．39，Issue17 2014年9月 eptember，2014 草珊瑚与金粟兰叶片双位点特异性 PCR鉴别方法研究 魏艺聪 ，陈莹 ，罗林泉 ，杨群雄 ，陈艺娟 ，梁一池 ，车苏容 (1．福建中医药大学 药学院，福建 福州 350122；2．福建农林大学 园林学院，福建 福州350002) [摘要] 筛选获得草珊瑚与金粟兰鉴别的特异位点并建立双位点特异性 PCR方法，用于鉴别草珊瑚与金粟兰叶片以及 两者的混杂品。采集不同产地的草珊瑚 18份、金粟兰6份，所有样品提取总DNA，并对草珊瑚与金粟兰干燥叶片进行DNA提 取。通过对其 ITS片段进行扩增、测序 ，并搜索GenBank数据库中收录的草珊瑚与金粟兰的ITS序列 ，进行同源比对后根据其 变异位点设计特异性鉴别引物，构建多重PCR体系，并优化PCR条件，对草珊瑚与金粟兰叶片进行快速分子鉴定。构建了多 重PCR鉴别体系，只经一个PCR反应 ，能扩增出草珊瑚580bp的特异性鉴别条带及金粟兰470bp的特异性片段，可快速鉴别 草珊瑚与金粟兰叶片，并可判断相互是否混杂。使用双位点特异性 PCR技术可以有效快速鉴别草珊瑚与金粟兰叶片，并可判 断相互是否混杂。 [关键词] 草珊瑚；金粟兰；叶片；特异性 PCR；分子鉴定 草珊瑚形态变异较大且与近缘植物形态极其相 近几年，位点特异性PCR方法为解决药材的鉴 似 ，加之名称的交叉混杂以及资源 的不足造成了误 别问题提供了客观而有效的手段 。近几年又不少利 采、误用，出现了金粟兰、鱼子兰等与草珊瑚功效不 用DNA分子遗传标记技进行中药材的分子鉴别方 尽相同的非药典收载的混淆品，特别是金粟兰，叶片 面的报道 ，位点特异性 PCR方法 已成功应用于陈 最为相似，而且金粟兰具有一定的肝毒性…。近几 皮、细叶藁、人参等中药材的真伪鉴别 。而国内 年来，随着草珊瑚野生资源却逐渐减少，而草珊瑚相 报道多见利用特异引物 PCR扩增某一特异条带的 关药品与商品的不断开发利用，市场对草珊瑚的需 有无进行辨别，这种辨别方法虽然可以鉴别某一 目 求越来越大，草珊瑚药材已出现供不应求之势 J。 标药材与其伪品的区别，但是一旦 目标药材中混有 草珊瑚相关商品中时常混有原植物为同科金粟兰属 伪品，就不能依靠单独的一条特异条带的有无进行 的金粟兰等混淆品的越趋常见。 鉴别 。为实现 目标药材与其伪品的快速鉴别，并判 目前，草珊瑚与金粟兰的鉴别可从原植物的叶 断是否混杂，以达到在相互混杂时可以快速、准确的 的形态与显微特征等传统手段进行一定程度的鉴 鉴别，本研究通过扩增草珊瑚与金粟兰属的易混种 定。但是叶片一旦干燥或经过加工，在实际运用中 ITS序列，并测序，结合GenBank数据库中收录的序 要通过叶片组织显微结构特征等传统方法进行准确 列，通过其 ITS序列差异分析，设计双位点特异的引 鉴别存在一定难度，对观察者经验的要求较高，缺乏 物，建立多重 PCR鉴别体系，为准确进行草珊瑚与 规范化标准化方法。而利用化学成分的分析进行鉴 金粟兰叶片及二者混合样品的鉴别提供快速检测 定，也及为繁琐，也难判断是否混杂。因此急需草珊 方法 。 瑚与金粟兰叶片，特别是干燥叶片的快速鉴定方法。 1 材料 PCR仪 (Eppendorf，型号5332)，电泳系统 (北 [收稿 日期] 2014-02—16 京市六一仪器厂，型号 DYY．12)，低温冷冻离心机 【基金项