抗神经钙粘连素噬菌体展示单链抗体与制备和鉴定.pdf

摘要 二十世纪九十年代工程抗体技术的发展开创了抗体研制的新纪 元。噬菌体抗体库技术更是倍受关注。噬菌体抗体将基因型和表型统 一于一体，将选择能力与扩增能力偶联起来，具有强大的筛选能力。 这使得通过基因工程方法制备抗体较之于传统的杂交瘤方法具有明 c11ain 显的优越性。单链可变区抗体(singlevariable劬gmenta【Itibody， 首尾相连组成的单敲链，它保留了亲本抗体可变区的特异性和亲和 力，稳定性好，易于在原核宿主中大量表达和在基因水平上进行改造。 用噬菌体展示抗体库技术，通过简便的吸附一洗脱一富集的筛选过程， 从而分离获得特异性抗体可变区基因，制备特异性抗体。还可根据需 要对抗体进行修饰、改造，从而获得供检测、治疗等广泛用途的试剂。 由于目前工程抗体技术尚未完善，难以制备高亲和力的抗体，本 实验尝试对抗原的性质和筛选策略等方面作了改进，以期获得较好的 结果。 分子家族的重要一员。近年的研究发现，它具有识别细胞、调控胚胎 组织器官形态发生及介导细胞信号传导等广泛的生物学功能。新近的 研究还显示N—ca血erin在造血微环境中对造血干细胞的调控起重要 体组织中的分布和生物学功能知之甚少。为此，借助新型抗体研制方 法制备特异性抗体，检测N．cadherin在人组织中的分布，并为进一步 研究打下基础。 1．神经钙粘连素胞外结构域的分离和表达 所表达的蛋白质免疫小鼠。结果，分离片段符合预期大小，DNA测序 正确。重组质粒转化宿主菌xLl．Blue后，经IPGT诱导表达出了约 70kDa的目的蛋白。免疫5次后，小鼠血清中可检出抗N—ca曲e湘 表达产物具有较好的免疫原性。 2．噬菌体展示多分子抗体微型文库的构建 用噬菌体展示技术构建抗神经钙粘连素分子胞外结构域、CD34 分子胞外结构域及ACl33分子的噬菌体展示单链抗体库。将3种分 子分别展示于噬菌体表面，用改进的免疫方法即以展示有3种分子的 噬菌体免疫BALB／c小鼠，提取脾总RNA，RT—PcR扩增抗体重、轻链 子胞外结构域、CD34分子胞外结构域及Acl33分子的噬菌体表达文 库。然后对文库的库容量、多样性、滴度及表达能力进行鉴定。结果， 用噬菌体展示的3种分子免疫小鼠获得成功，所构建抗体文库的库容 量、多样性、滴度及表达能力均能满足进一步筛选目的抗体基因的需 要。因而，为制备相应的特异性抗体奠定了基础，建立了同时用任意 多个抗原分子制备相应特异性抗体的技术平台。 3．抗神经钙粘连素单链抗体的筛选和鉴定 构建抗N．cadherin分子胞外结构域的噬菌体展示单链抗体库。所构建 抗体文库的库容量、多样性、滴度及表达能力均满足进一步筛选目的 抗体基因的需要。通过改进筛选方法，经4轮富集筛选后，用 合活性的阳性克隆。对其中2个(编号分别为pN22和pN32)阳性 标记。免疫学分析显示，所获scFv有较好的N．cadherin结合活性， 验检测人胎儿肾组织，N．cadherin主要分布于远端小管和集合小管细 胞上，显色清晰。显示本实验通过优化筛选方法，获得了高亲和力的 抗体。初步的试验显示所获scFv叫22)有明显抑制kGla细胞的同型 聚集作用，而与之有类似结构的抗phox的scFv无抑制细胞的聚集作 用。提示N22能作用于N．cadllerin而影响信息传递，影响细胞的生 物学功能。 4．N．cadherin在人胚胎于细胞和胎儿组织中的表达谱分析 为了解N．cadherin在人胎儿各组织中的分布情况，用半定量 RT_PCR和免疫组织化学染色方法对人胚胎干细胞、精子、正常人3 Ⅱ 个月的胎儿不同组织中N-cadhe“n的表达情况进行检测。结果显示， N．cadherin基因广泛表达于人胚胎干细胞、精子以及胎儿的脑、心、 肺、肾、睾丸、软骨细胞及骨骼肌等组织中，其中以脑、心及骨骼肌 等组织表达量多。免疫组化实验也表明N．cadllerin蛋白广泛分布于上 述组织中，只是肝、肺及肾上腺表达极微，这可能是转录后调控机制 作用的结果。在肾组织中，N．cadherin主要分布于远端小管和集合小 管细胞上，几乎不见于其他部位，与文献报道在大鼠肾中主要表达于 近端小管有所不同。 关键词神经钙粘连素，细胞外结构域，免疫原性，CD34， ACl33，噬菌体展示，单链抗体