体细胞克隆在肉牛育种上的研究进展及展望.pdfVIP

1,2 1,2,3* 1,2,3 1,2 1,2 （1.山东省黑牛繁育工程技术研究中心，山东青岛 266109 ；2.青岛农业大学动物胚胎工程中心， 山东青岛 266109 ，3. 山东布莱凯特牧业科技有限公司，山东淄博 256306 ） 摘要：随着体细胞克隆技术的发展，体细胞克隆在肉牛育种领域有着越来越重要的价值，近年来，克 隆技术不断完善，克隆方法不断优化，取得了很多重要的成果，但在成功率等方面仍存在许多难以攻破的 问题。哺乳动物转基因技术的不断成熟，并与体细胞克隆相结合在肉牛育种上也得到应用，取得了一定的 成果。本文重点阐述了体细胞克隆在肉牛育种上的研究进展及其展望。 关键词：体细胞克隆，肉牛，转基因，育种 1 牛体细胞克隆 1.1 哺乳动物体细胞克隆 哺乳动物细胞核移植(Nuclear Transfer)是指通过显微操作的方法，将供体细胞的细胞核 放入预先去核的成熟卵母细胞或早期合子内，形成一个新的核质重组体，移入的核在受体胞 质的作用下，发生发育程序重编(reprogramming)，使得核质重组体与正常受精卵一样，经细 胞分裂、分化并在母体内发育成一个新的个体。核移植技术是动物克隆(cloning)技术的最主 要组成部分，目前受到人们广泛关注的克隆技术实际上只是指核移植技术。克隆是指通过无 性繁殖(asexual reproduction) 的方法从一个细胞或个体产生一组遗传上完全相同的细胞或个 体。由于动物核移植具有能使遗传性状优秀的个体大量增殖，加快动物育种进展，扩大转基 因动物后代数，提高转基因动物效率，克隆出预知性别的动物，满足生物医学研究实验动物 的特殊需要等优点，从而引起了人们的广泛关注。因此，核移植技术在最近几年得到了迅速 发展和广泛应用。 1997 年，Wilmut 等[1]得到了举世瞩目的第一只成年体细胞核移植绵羊后，体细胞核移 植才受到广泛的关注，人们才开始重新认识细胞分化的本质以及细胞分化的理论基础，Wil mut 等用来自胎儿成纤维细胞和成年绵羊的乳腺上皮细胞进行核移植，得到了来自胎儿成纤 维细胞的三只核移植绵羊和一只来自成年体细胞的核移植绵羊“Dolly ”，首次证明了成年 动物分化的细胞具有发育的全能性，可以维持核移植胚胎发育到出生。多莉的出现，使哺乳 动物核移植进入了一个崭新的阶段。 1.2 牛体细胞核移植研究进展 在哺乳动物的体细胞核移植研究领域，牛体细胞核移植研究的最广，得到的克隆个体也 最多，并取得了重大进展。1995 年，Delhaise 等就用核移植方法证明来自牛雄性胎儿的原生 殖瘠细胞在受体胞质内可以发生发育程序的重编，核移植胚可发育到囊胚。1997 年，Lavior 等从胎儿的原生殖峭分离到原始生殖细胞和卵原细胞，并将这些细胞冷冻保存，在解冻后与 去核的卵母细胞相融合，重组胚可以卵裂但不能发育到囊胚期。而后他们又以牛新鲜和冷冻 的卵原细胞，早期卵裂球和颗粒细胞为供体构建重组胚，结果重组胚在融合后40h 的卵裂率 无明显差异，且由这些供体构建的重组胚有部分可以发育到囊胚期，当来自卵原细胞的桑堪 胚和囊胚移植到受体后，重组胚可以发育为胎儿和胚外组织。这些都为体细胞克隆牛奠定了 基础。 [2] 1998 年 Kato 等 由l 头牛的卵丘细胞和输卵管上皮得到 8 头犊牛，这是世界首次体细 胞克隆牛成功，该结果进一步证明己分化的成体动物细胞具有发育全能性，经核移植后可以 获得后代，使体细胞克隆牛胚胎体外发育的桑囊率达到较高的水平。随后 Cibelli 等[3]用转染 的胎儿成纤维细胞作为供体得到了体细胞核移植牛犊。我国于 2001 年 11 月 3 日和 11 月 6 [4]首次应用负压气相培养系统生产出了 2 头黑色雌性肉牛“康康”和“双双”， 日，由董雅娟等 并通过徽卫星 DNA 标记确认，克隆牛“康康”为来源干日本和牛 Vari-Fe-8mos 的牛胎儿皮 肤上皮细胞，“双双”来源于日本和牛 Fahru-Fe-9mos 的牛胎儿皮肤上皮细胞。 1.3 体细胞克隆牛的制作过程 1.3.1 受体卵母细胞的准备 卵母细胞的来源有两种：一是用激素对雌体进行超排处理，从输卵管冲出体内成熟的 M II 卵母细胞。二是从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘-卵母细胞复合体(COC