雏鸭致病性大肠杆菌gyrA、parC和marOR基因与氟喹诺酮耐药性的研究.pdfVIP

第六嗣理事会第二次会议■教学专业委员会2006年会议论文集 耐药性的研究 李玲l，汪铭书l，2，程安春l，2，·，于小娜1，钟传德l，段泽1，陈孝跃l (1．四川农业大学动物科技学院禽病防治研究中心，四川，雅安，625014；2．动物疫病 与人类健康四川省重点实验室，四川，雅安，625014) 摘囊：筛选临床分离的18株耐氟喹诺酮类药物的雏鸭致病性大肠杆茵，PCR扩增其gyrA的QRDR区、 内切酶酶切分析、单链构象多态性和测序分析．结果表明，有15株耐筠茵株的gyrA基因的83位氨基酸处 gyrA的基因突变介导穴膊杆笛对氟喹诺酮类药物的耐筠，而parC基因的突变促使细茵的耐药程度增加． 丧失阻遏功能，影响MarR与DNA的结合，造成M时A的过度表迭，在犬肠杆茵对喹诺酮类药物的耐药和 多重耐药中起一定作用． 关键诩：雒鸭；致病性犬肠杆茸；氟喹诺酮类琦物；耐药性；射rA；pa陀；ma哟R ·程安春和汪铭书为通讯作者 发展最迅速、疗效最显著的一类化学合成药。代表产品有诺氟沙星、氧氟沙麈、环丙沙星。 其综合临床疗效对革兰氏阴性菌来讲，已经超过了青霉素族，达到了第一代、第二代头孢菌 素的效柴。现已泛用于人医临床和兽医治疗和预防细菌感染性疾病。随着这类药物的广泛应 用，细菌对其耐药性呈现明显的增加趋势。细菌对其产生的耐药机制主要有3种：编码靶 ．DNA螺旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的基因突变；膜的通透性降低：主动外排系统功能的增加。大 因突变所致。该型突变导致对多种结构不同的抗生素耐药，其中包括喹诺酮类药物。突变区 域集中在mar操纵子的调控区即marOR区域内。本试验对临床耐药的雏鸭致病性大肠杆菌 的靶位基因gyrA、parC和非靶位基因marOR突变机制进行了研究。 1材料与方法 1．1蘑株 临床分离的雏鸭致病性大肠杆菌，经药敏试验筛选出耐环丙沙星、诺氟沙星和氧氟沙星 的菌株18株，保存于四川农业大学禽病防治研究中心；大肠杆菌标准菌株ATCC25922，购 自中国兽医药晶监察所。 1．2生羹试剂 限制性内切酶Hinfl、dNTP、琼脂糖、Taq酶购自大连宝生物公司；丙烯酰胺、二甲 基双丙烯酰胺购于Sigma公司；TEMED购于Merck公司，其他试剂均为国产分析纯。 1．3模板染色体DNA的提取 参照文献川进行，将提取的DNA置于．20C保存备用。 1．4引物设计 较强的引物用于PCR扩增，所设计的引物序列如下： gyrA QRDR下 1 游引物P2： 5ⅥrAGAAcCGAAG兀ACCCTGA．3’(3 6-333)，扩增产物长度20杏bp；parC QRDR下游引 物P4：5’-TGGTCGAT，rAATGCGAl门r． ．．499．． 禽类传染病 氟喹诺酮类药物耐药决定区(QRDR)。以上引物由上海基康生物技术有限公司合成。引物 用灭菌双蒸水稀释成25}tmol／L的引物应用液。 1．5PCR扩增 取0．25mL的微量离心管3只，分别加入ddH2033．5皿，10xBuffer5灿，MgCl2 PCR产物检测采用1．5％琼脂糖凝胶电泳50min。 1．6 QRDR的PCR产物的限制性片段长度多态性分析(RFLP) gyrA 反应体系： 10xBuffer，1lxl：Hinfl(10u／i．t1)，0．51xl；gyrAPCR产‘物，5p．1； ddH20，3．5山。反应条件：37℃水浴4h。酶切产物经2％琼脂糖凝胶电泳2h后观察。 1．7 QRDR的PCR产物单链构象多态性分析(SSCP) part2 采用7％聚丙烯酰胺凝胶：30％丙烯酰胺溶液，9．3ml； 5x