大肠杆菌工程菌株表达重组磷脂酶D催化条件优化的研究.pdfVIP

大肠杆菌工程菌株表达重组磷脂酶D催化条件优化的研究 刘逸寒 乔婧 路福平 工业发酵微生物教育部重点实验室，工业酶国家工程实验室， 天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300457 [摘要]磷脂酶D(PhospholipaseD，简称PLD)可催化转酯反应，具备催化磷酸二酯 键水解和碱基交换反应的能力，能够定向催化卵磷脂和L-丝氨酸生成磷脂酰丝氨酸。 本研究利用实验室已构建的可表达PLD的大肠杆菌工程菌株BL21/pET22b-pld，对PLD 催化L-丝氨酸和卵磷脂生成PS的体系进行优化，以期获得较高产量的磷脂酰丝氨酸， 优化后PS产率为12.5％，是优化前的2.19倍。 [关键词]磷脂酶D；催化条件；优化；磷脂酰丝氨酸 第三届全国酶制荆研究开发应用技术研讨会论文集 构建并保藏。 1．1．2培养基 7．2。 LB培养基：蛋白胨109／L，酵母粉59／L，氯化钠109／L，pH 1．2方法 1．2．1培养方法 1．2．1．1菌种活化 从在．70C保存的甘油冻存管中挑取一环菌液，在含有氨苄青霉素(终浓度为 LB液体培养基中培养过夜，进行菌种活 氨苄青霉素(终浓度为100pg／mL)的5mL 化。 1．2．2重组PLD的获得 将活化后的菌种以2％的接种量接入含有氨苄青霉素(终浓度为100鹏／IllL)的50mL 声破碎，上清液经镍离子柱纯化嘲后获得PLD。 1．2．3催化条件的优化研究 lOOmin，总体系20mL，加入2UPLD，此时PS产率为5．7％。 采用单一因素法，根据实验要求变更催化条件包括有机相的选取、反应温度、pH、 底物摩尔比、反应时间，以PS产率为指标进行优化。 1．2．4测定方法 1．2．4．1 PS检测方法： HPLC检测条件如下： Luna NH2；流动相：乙腈：甲醇：85％磷酸=100：3：l； 色谱柱：phenomenex 紫外检测波长：205rim：柱温：25(2；流速：lmL／min：进样量：15止。 2结果与讨论 2．1有机相种类和浓度对PS产率的影响 103 第三届全国酶制剂研究开发应用技术研讨会论文集 日氯仿 茬4 一乙醚 口乙酸乙酯 口四氢呋喃 厶i k_ 有机相浓压强 图1 有机相种类和浓度对PS产率的影响 本实验中，采用氯仿、乙醚、乙酸乙酯和四氢呋喃4种溶剂作为反应介质，酶促 合成PS的结果如图1，可看出氯仿和乙醚都表现出了较高的转化率，当选取浓度为40％ 的乙醚时，PS产率达到最高，为7．1％，乙酸乙酯和四氢呋喃转化率较低，都不适合作 为反应的有机相。 2．2反应温度对PS产率的影响 O 8 7 6 摹糌k∞山 5 4 3 2— 24 26 28 30 32 34