Serratia+liquefaciens磷脂酶A1在大肠杆菌的克隆表达及酶学性质研究.pdfVIP

Serratialiquefaciens磷脂酶A1在大肠杆菌的克隆表达 及酶学性质研究 延晋雷 张梁 石贵阳 江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122 江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡214122 [摘要]磷脂酶A1由于其在油脂脱胶、磷脂改性和饲料改良等行业的广泛应用近年 来成为研究热点。本研究采用PCR方法得到Serratialiquefaciens的磷脂酶A1基因 （phlA），将克隆得到的phlA基因与载体pET-28a(+)构建质粒pET-phlA，转化宿主 菌BL21(DE3)，实现了去信号肽的磷脂酶A1的表达。利用乳糖自诱导方式，测得发酵 液上清酶活63.2U/mL，细胞破碎液75.8U/mL，对细胞破碎液的SDS分析得到 一条约33.2kDa的特异性条带。该磷脂酶A1的最适作用温度和pH值是55℃和6.0， 在70℃保温2h仍具有74％的活力，具有一定的耐热性。 [关键词]磷脂酶A1;克隆表达；乳糖自诱导；酶学性质 第三届全国酶制剂研究开发应用技术研讨会论文集 1．材料与方法 1．1菌株，质粒和培养基 CICC 21538购自中国工业微生物菌种保藏管理中心：大肠杆 菌种S砌uefaciens 菌(Escherichia TakaRa公司，质粒pET-28a(+)为本实验室保藏。 LB培养基：蛋白胨10 10 g／L、酵母粉5 g／L、NaCIg／L； 种子培养基(zYP-0．8G)：蛋白胨10 mM g／L、酵母粉5∥L，葡萄糖8g／L，25 Na2HP04；25mMKH2P04；50mMNH4C1；5mMNa2S04；2mMMgS04。‘ 发酵诱导培养基(zYp一5052)：蛋白胨10 g／L、酵母粉5∥L，甘油5∥L，葡萄 mM mM mM mM 糖0．5 Na2HP04；25KH2P04；50NH4Cl；5Na2S04； g／L，乳糖2gel，25 2mM MgS04；2--一109M金属离子。 1．2工具酶及主要试剂 DNA聚合酶、dNTP、T4．DNA连接酶、限制性内切酶EcoRI和HindlII购自大 Taq 连宝生物公司。DNA分子量标准和纯化DNA片段的琼脂糖凝胶回收试剂盒、蛋白质分 子量标准等均购自北京博大泰克生物基因有限公司，引物合成及测序由上海生物工程 有限公司完成。其余试剂为国产分析纯。 1．3phlA基因的克隆 的PCR引物。 3’(酶切位点) 3’ buffer 反应体系：lOxTaq min， 扩增条件：95℃预变性5mill；95℃变性30s，57℃退火30S，72℃延伸l min。 30个循环；72℃延伸10 JMl09，挑取阳性 所得片段胶回收后与克隆载体pMDl8．T载体连接，转化入Ecoli 转化子。提取质粒酶切鉴定，将重组质粒命名为T-phlA，并经测序验证。所运用的基 因操作、Ecoli感受态细胞制备和转化以及SDS．PAGE等技术按参考文献【7l进