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适用于老年帕金森病 研究的MPTP的理想造模剂量 首都医科大学宣武医院 吴燕川 于向东 王玉兰 冯秀丽 陈彪 帕金森病是老年人常见的以震颤、肌强直、运动迟缓为主要临床症状的神经系统变性疾病。其发 生机制与黑质一纹状体中多巴胺含量减少有关。Carlson等在20世纪50年代对啮齿类动物注射利血 平使其纹状体内儿茶酚胺缺乏，动物产生类似帕金森病样症状，这是最早建立的帕金森病动物模型。 以后随着儿茶酚胺特异性神经毒素6一羟基多巴胺及哌替啶类衍生物1一甲基一4一苯基一1，2，3，6 种动物进行广泛研究。利用C57／BL小鼠注射MPTP造模的方法有多种，而且剂量也各不相同，本实 验试图探讨MPTP造模的最佳剂量。 1材料和方法 材料：选择SPF级C57BL／6L小鼠60只，雄性，体重(20 4-2)g，每笼5只喂养，动物自由觅食喝 水，喂养1周，适应环境后开始实验。药品：M胛P·氯化氢(美国Sigma公司)；多巴胺·氯化氢(瑞士 Packard Fluka公司)。仪器：Hewlett1050高效液相色谱仪，1049A电化学检测器(美国，惠普公司)； Scientif- JY92一II超声波细胞粉碎机(上海新芝生物技术研究所)；超低温冰箱(一800C)(德国Forma ic)；3K30型低温超速离心机(美国Sigma公司)。 方法：小鼠帕金森病模型的制备：参照Richard等H的方法，适当加以改进。将60只小鼠随机分6 组外，各组均有1或2只小鼠在处死前死亡。 t小鼠脑组织纹状体的取样：取造模7d的小鼠，迅速断头取脑。将大脑背侧放置在铺平半张滤纸 的冰台上，小心把前脑放平，定位前脑嗅球界限，嗅球卵圆形结节。用解剖刀片沿嗅球界限与嗅球之 间1／3处垂直切去前部脑组织及后部，迅速检查切面，应能看到纹状体顶部及胼胝体。双侧纹状体正 在中前结合处。如果切得稍微向后一点，可以看到双侧前联合。如果切面看到纹状体顶部及胼胝体， 则另一冠状切面应向后lmm；如果看到双侧前联合切面，则另一切面应厚于lmm。分离双侧纹状体： 沿前联合背部切去腹侧脑组织A—A；垂直切去面侧脑组织B—B；沿c—c线切去背侧脑组织；切去纹 状体两侧的隔膜，取出纹状体D—D。迅速检查有无附着组织并去掉，将纹状体放人编码后的管内，称 重后置于液氮中。 样品中多巴胺的制备：将组织放人内有lmL冰冻0．4moL／L高氯酸的微量离心管中，超声破碎直 上清液转入试管中，取20(L准备进样分析多巴胺。移出过量上清液，沉淀加0．5moVL氢氧化钠 lmL，冷冻过夜，用Lowry法测沉淀中的蛋白质含量。 钠调pH值至4．70。流动相用0．221zm膜抽滤，在HPLC上校准标准品。 一73— 酸铜、209／L酒石酸钠以50：50：1：l的比例混合均匀，当天使用。试剂乙(酚试剂)：购自北京鼎国生 物技术发展中心。标准曲线绘制：取6个Eppendorf管，分别加入标准牛血清白蛋白溶液，其中分别含 测定：样品适当稀释，取0．4mL如上测定，从标准曲线上查出其蛋白质的含量。测定结果以多巴胺含 量／蛋白含量表示。统计学分析：采用SPSSl0．0进行数据处理，数据以X(s表示，均数间比较行t 检验。 2 结果 MPTP20mg／kg腹腔注射每2h1次，注射3次组为(44．904-18．41)斗∥g，是正常对照组的32．92％； MPTP45mg／kg皮下注射1次组为(74．13 显著(P0．01)。 表1不同剂量MPTP对小鼠纹状体内DA含量的影响 注：与对照组比较，木P0．05，毒掌P0．01；与M1组比较，妒0．05，槲JPO．01 3讨论 ．。 MPTP的毒性作用是在1982年加利福尼亚州一群男子因其吸食不洁的海洛因而患上严重亚急性 帕金森病这一事件中发现的。患者表现出与帕金森病患者非常类似的症状：运动迟缓、僵直、姿势不 稳、静止性震颤，尸检证实了黑质的损伤。从此MPTP成为诱导黑质退行性病变模型的有效药物，对 多个种系，如小鼠、狗、猫、猴都能诱导出帕金森病样症状。向黑质和内侧前脑束注