弱阴离子交换、超滤两级法纯化浓缩卵黄蛋白原(Vtg)地研究.pdfVIP

第三届全国环境化学学术大会论文集 E-52 弱阴离子交换、超滤两级法 纯化浓缩卵黄蛋白原（Vtg ）的研究 2 刘宝敏 袁东星 吴翠琴 厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室，厦门大学环境科学研究中心， 厦门 361005 关键词：弱阴离子交换；超滤；卵黄蛋白原 分 类：环境化学与毒理学研究 1 引言 卵黄蛋白原（Vtg ）是一种雌性特异性蛋白，其产生过程简述如下：雌性动物在生殖周 期内由下丘脑－垂体－性腺系统刺激卵巢分泌内源性雌激素 E ；在血液循环系统的作用下， 2 E2 被转移至肝脏，被动分散入肝细胞，与雌激素受体结合，刺激 Vtg 基因的转录，并合成 卵黄蛋白原[1] 。但是，由于外源性内分泌干扰物（EDCs ）也可以为雄性特定的靶组织器官 所吸收，模拟正常激素的功能，也能产生 Vtg [2] 。因此，Vtg 可以作为环境雌激素的生物标 志物，对其的纯化及分析也因此成为研究热点，受到越来越多的关注。 Vtg 的分子量范围为 300～600KDa 。在血液中，它是一种二聚体磷脂大分子量蛋白质[3]， 对其纯化可采用凝胶渗透法[4]。另外，由于Vtg 的多电荷性[5]，也可以采用阴离子交换法纯 化[6] 。大多数研究均采用离子交换与凝胶渗透两级操作来纯化Vtg [7]，其过程繁琐耗时。经 过这样操作得到的 Vtg 浓度较低、含盐量较高，必须经过透析脱盐后才能冷冻干燥以备用。 本研究采用弱阴离子交换液相色谱法粗步纯化 Vtg ，得到的Vtg 粗馏分经超滤膜进一步除去 小分子蛋白杂质，同时脱盐浓缩。两级纯化后的 Vtg 经高分辨强阴离子交换液相色谱分析， 证明所得馏分纯度较高，可以用于进一步的定量分析。 2 试验材料与方法 饲养在网箱中的真鲷按 1.9mg/Kg 体重的剂量，腹腔注射 E2 。对照组只注射同样体积的 无水乙醇和生理盐水。诱导 7 天后，用 1250 U/mL 肝素钠润洗后的一次性注射器从鱼尾静 脉取血，血液加入酶抑制剂 PMSF 和 EDTA 后，4 ℃ 425g 下离心 10min，取上清，分装，-80 ℃保存。对照样血清以同样方法处理。 稀释后的血清样经 DEAE-Sepharose Fast Flow 弱阴离子交换柱分离后，收集不同谱峰的 馏分。如此一级纯化得到的 Vtg 粗馏分在 5mL 超滤管中 4 ℃下 5000g 离心 8min 进行二级纯 化，将超滤膜截留液吸出后备用。两级纯化后的 Vtg 浓缩液经 Mini Q 高分辨阴离子交换液 相色谱－紫外检测器分析，验证其纯度。 3 实验结果与分析 卵黄蛋白原的离子交换一级纯化：图 1 是弱阴离子交换色谱一级纯化所得的 Vtg 的高 分辨离子交换色谱图。如图 1 所示，诱导样血清和对照样血清分别经过弱阴离子交换色谱分 离后，诱导样在 tR ＝24 －32min 处比对照样多一个色谱峰，初步认定此色谱峰所对应的蛋白 主要为 Vtg 。另外，从图 1 也可以看出，诱导样的蛋白总量明显比对照样的多，这与有关文 献[8] 的报道一致。 2 国家自然科学基金资助项目） 联系方式：yuandx@xmu.edu.cn V-100 第三届全国环境化学学术大会论文集 mV 21 对照样 15 诱导样 9 3 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 min