骨炎定促进血管内皮细胞增殖的血清药理学研究_医学论文.docVIP

骨炎定促进血管内皮细胞增殖的血清药理学研究_医学论文 骨炎定促进血管内皮细胞增殖的血清药理学研究_医学论文 作者：曹燕明徐海波张薇陈基长 【关键词】骨性关节炎/中药疗法,骨炎定/药物作用,细胞培养,兔 摘要:【目的】观察补肾益气活血方骨炎定对血管内皮细胞增殖的影响。【方法】将新西兰兔随机分为空白组和骨炎定低、中、高剂量组（剂量分别为2.5、5、10g/kg）以骨炎定高剂量灌胃给药，连续7d，于最后1次给药后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h分别取血，分离含药血清，作用于人脐静脉内皮细胞，以四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测不同时相的骨炎定含药血清对血管内皮细胞的增殖作用并取给药后2h含药血清，部分灭活，比较灭活血清与不灭活血清对血管内皮细胞增殖的影响，以及检测不灭活含药血清不同作用时间（12、24、36h）对内皮细胞增殖的影响以骨炎定低、中、高剂量灌胃给药，连续7d，取最后1次给药后2h含药血清，观察不同剂量骨炎定对血管内皮细胞增殖的影响。【结果】高剂量骨炎定给药后0.5～4h制备的含药血清对血管内皮细胞增殖均有显著促进作用（均0.01），其中以给药后2h者作用最强灭活与不灭活血清均对血管内皮细胞增殖具有促进作用（0.01），且后者作用强于前者（0.05）不灭活含药血清作用12、24、36h后均对血管内皮细胞增殖具有促进作用（0.01），且呈时效关系低、中、高剂量骨炎定含药血清均对血管内皮细胞具有促进作用（0.01），并呈量效关系。【结论】补肾益气活血方骨炎定对血管内皮细胞增殖具有促进作用。 　关键词:骨性关节炎/中药疗法骨炎定/药物作用细胞培养兔 　在骨性关节炎（OA）的病理机制中，骨组织血管萎缩、数量减少、血供不足是非常重要的一环，而血管在骨的形成和修复过程中所起的重要作用在于丰富的血管是保障骨组织再生时血供充分的必要条件［1］。补肾益气活血方骨炎定（Guyanding）是陈基长教授根据中医理论，并结合自己多年的临床经验总结出的经验方，主治骨性关节炎。经多年临床研究证实，该方可改善OA患者的关节疼痛、肿胀和功能障碍，改善骨内压和异常的血液循环，在临床中取得显著疗效［2］。本文观察了骨炎定含药血清对促进血管内皮细胞增殖的影响，现报告如下。 　1材料与方法 1.1药物骨炎定由红花、牛膝、补骨脂、骨碎补、黄芪组成，按常规方法煎煮，经纱布过滤并浓缩成含生药2kg/L的药液，置4℃冰箱保存备用。1.2动物新西兰兔，雌雄各半，体质量（2.0±0.2）kg，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号为2000A018。 1.3实验方法 1.3.1不同时相的含药血清促进血管内皮细胞增殖的作用［3-4］新西兰兔4只，随机分成空白组和骨炎定组，雌雄各半。骨炎定组以10g/kg剂量灌胃给药，空白组以等容积的蒸馏水灌胃，每天2次，早晚各1次（每日药物总量相当于60kg成人临床用量的20倍），连续7d。于最后1次灌胃（灌胃前禁食不禁水12h）后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h兔耳中央动脉采血，无菌分离血清，经0.45μm、0.2μm双层微孔滤膜过滤除菌，置-40℃低温冰箱保存备用。将购自CCTCC（中国典型培养物保藏中心）的人脐静脉内皮细胞培养至第3～5代，以含体积分数为15%小牛血清的DMEM培养液调成5×107个/L的细胞悬液，100μL/孔接种于96孔培养板中，于37℃、体积分数为5%CO2温箱中饱湿静置培养48h更换无血清的DMEM培养液，使细胞同步化12h，每孔加入100μL不同时相采集的空白兔血清或骨炎定含药血清，每组均设8个平行孔，总体积为200μL/孔置37℃、体积分数为5%CO2温箱中饱湿静置培养36h，每孔加入5g/L的四甲基偶氮唑盐（MTT）溶液20μL，继续培养4h以进行显色反应以体积分数为50%二甲基甲酰胺（DMF）―200g/L十二烷基硫酸钠（SDS）0.1mL终止反应，室温静置过夜待孔内蓝色结晶完全溶解后置酶标仪上测波长570nm处吸光度（D）。 1.3.2血清灭活与否对血管内皮细胞增殖的影响［4-5］按1.3.1方法选取最后1次灌胃给药后2h的兔进行耳中央动脉采血，无菌分离血清，一部分血清经56℃、30min灭活处理一部分不灭活，经0.45μm、0.2μm双层微孔滤膜过滤除菌，置-40℃低温冰箱保存备用。采用1.3.1方法检测灭活血清和不灭活血清对血管内皮细胞增殖的影响。 　1.3.3不同剂量的含药血清促进血管内皮细胞增殖的作用［3，5］新西兰兔8只，随机分成空白组和骨炎定低、中、高剂量组，雌雄各半。骨炎定低、中、高剂量组分别以2.5、5、10g/kg灌胃给药，空白组灌胃等容积的蒸馏水，每天2次，早晚各1次（每日药物总量分别相当于60kg成人临床用量的5倍、10倍、20倍）