抗病基因转化甜椒培育新抗源地研究初报.pdfVIP

抗病基因转化甜椒培育新抗源的研究初报 郭亚华 谢立波 邓立平 王雪 黑龙江省农业科学院园艺分院 摘要：本项研究，通过农杆菌介导法及花粉管通道法两条途径，将CMV-cp，TMv-ep基因导入 甜椒外植体(植株)获得转基因植株(后代如代)．并通过PCR分子检测。证实外源基因被整合。对 其进行田间多代抗性鉴定与筛选，育成双抗CMV、TlvlV甜椒新资源。 关键词：势农杆眇导澎花粉妒道澎咖翘匝盈》 一、材料与方法 1材料 1．1酶与生化试剂 所用的限制性内切酶及其它酶均购自哈尔滨天象人生物工程公司，尼龙膜为哈尔滨平皓生物 工程公司产品，其它生化试剂均为进口或国产分析纯。 1．2植物材料和培养基 供试辣椒品种为“龙椒二号”(简称“龙二”)为本所自育的常规品种，方果型、甜脆；‘k19262”为 本所自育，采用空间诱变育种途径培育而成的稳定纯系，梯形果、昧麻辣。 培养基成分：分化培养基(A)：Ms(1962)+6BAld 培养基：Ms(1962)+6BA2,,a+GA3 2q ^+羧苄青霉素500rag／l+含卡那霉素50rag／l+3％蔗糖，pa5．8。 1．3供试菌种及来源： TMV-ep基因及卡那霉素(k’m)，壮观霉素(spe、)，链霉素(sm’)。 菌种及来源 217 质粒结构图 BamHl EcoRI EcoRJBamH 0 上 ‘ J 1．4 POR引物 转基因植株PCR检测所用两对引物由上海生工生物工程公司合成。其中CMV5’引物为 cA一3’；TMV5’引物为P15’_，rrcAC,-C GAGGTGTGGA从c叫’，3’引物为P25’—Gc 2试验方法 2．1外源DIIA的导入： 2．1．1 Rj质粒介导法 (1)外植体的准备 取两供试品种(龙二、L9262)挑选籽粒饱满，整齐一致的种子用温水浸泡48小时取出，在 无菌条件下，用75％乙醇消毒30秒，用无菌水冲洗3遍，再浸入0．1％升汞中8．10分钟，取出用 照30001x，10小时。10．14天左右长出无菌苗将无菌苗，在超净台上切成子叶、下胚轴上部、下胚 轴下部三段，将各段再接种于MS0培养基上培养24小时后用于转化。 (2)转化子菌液感染外植体 感染方法：浸泡法(外植体在菌液中浸泡) 针刺法(用注射器吸取菌液刺入外植体各部分) 感染浓度：10×、15x两种浓度 浸泡感染时间：15分钟、30分钟、60分钟，浸后用无菌水冲洗3-5次。 218 试验因素和水平 (3)除菌和抗性筛选： 感染后外植体在分化培养基上培养，3天后，细胞开始启动，进行除菌培养。每隔I-2天更换 一次培养基，连续更换4-5次，结束除菌，转入选择培养基上2周后开始出现愈伤组织。 (4)转基因植株的诱导： 在选择培养基上，诱导愈伤组织或不定芽。每隔2周更换一次培养基，4周后不定芽伸长至 2era左右，即可转入到诱根培养基上诱导产生完整的再生植株。 2．1．2花粉管通道法 将外源目的基因(带有CMV-cp．TMV-cp基因的转化子菌液)直接导人甜椒的花器官中。 2．1．2．I导入时间 导入时间是影响导入效果的一个关键因素，应当选择授精过程和胚胎发育早期，细胞分裂最 旺的阶段导入，这时受体卵子或合子及初期胚胎细胞不具备细胞壁或细胞壁不健全，易于外源 DNA导人转化。但外源DNA能否导入并聚合，是．DNA、细胞、环境三者互作的结果，因而，花粉 管通道法具有很大的随机性。要视具体作物、具体品种，其花器大小、柱头长短、花粉管伸长的 速度等都会直接影响授精时间。本项研究经多年实践，认为对甜椒而言，导入时期应选”二荚椒“ 的花，其开花前一天的白色大花蕾进行套袋，防止风或昆虫的异花授粉，待开花后，当花瓣平展 或下斜展时(大约开花后12h(d