猪戊型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用.pdfVIP

第十三次学术研讨会会议论文集 猪戊型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用 刘美1 邱蜜蜜1孟轲音2丁壮1．叶俊青1丛彦龙1李志杰1 李少丽1王昌庆1吴昊1 30062) (1、吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春，1300622、军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春，1 攮要根据GenB孤k中注册的AJ272108等序列，参考Meng等的文献，利用引物设计相关软件在HEvoRF2片 段的保守区设计并合成一对引物及探针，采用TaqM锄探针建立了荧光定量PcR法．以鉴定正确的质粒为模板建立 光定量PCR方法扩增效率高、线性范围广，为快速检测猪戊型肝炎病毒的绝对定量分析奠定了基础。 关冀词猪戊型肝炎；实时荧光定量PCR；TaqM柚探针 1955一1956年在印度因水源污染第一次暴发了以黄疸型为特点的戊型肝炎【l】，之后戊型肝炎在 亚洲、南美洲、中东和非洲的北部和西部等地区流行。1986～1988年在我国新疆南部地区发生戊 其与人类的HEV有极高的同源性，并可感染黑猩猩和恒河猴，这一发现推测猪可能是HEv 感染的一个动物宿主。最近，在美国、中国台湾、荷兰和日本等地许多猪戊型肝炎病毒株已经从 猪身上分离得出m5’瓢7’8、9、m】。在2002年的国际猪病大会上，作为一种新发现的传染病，猪 的戊型肝炎受到了高度重视¨¨。 基于对HEV基因组的研究结果，迄今为止，针对不同的基因型，已建立了多种相应的以检测 抗HEV抗体及HEVRNA的诊断技术，即采用基因工程重组抗原建立的抗体诊断方法，以及采用 逆转录一聚合酶链反应(RT。PCR)建立的基因诊断方法。 nuorescence 实时荧光定量PCR(Real．timequaIltitativePCR)是近年发展起来的一种新的实时 定量检测特定核酸技术，它分绝对定量和相对定量。绝对定量PCR是用标准曲线来检测未知样本 的精确拷贝数；相对定量PCR是检测未知样本间基因表达的差异。依据PCR过程的监测检测模式 GI优n 可分为以下几种：sYBR FRET)。本研究是基于TaqMall探针技术的敏感、特异、具高度重复性而建立的实时荧光定量PCR 方法以此来检测猪戊型肝炎病毒。 1材料与方法 1．1粪便样品 分别采自吉林省双辽市猪场22份、安徽省巢湖市和县两个猪场共90份的2—3月龄猪新鲜粪便。 1．2毒株 分离保存，猪水疱病病毒zY株购自中国兽药监察所。 1．3载体、蕾株及试锕 克隆载体PMDl8一T Simple DNA聚合酶、dNTP Reagent购自Illvi仃ogen公司，M．MLⅣ、RNaseiIlllibitor购自Fe舯entas公司，戤勋9 司，PCRsT对PCAPs购自杭州爱思进生物技术有限公司。 1．4引物与探针的设计 公司合成，预期扩增产物长度为113bp。 上游引物Pl：5‘．CTGrn7AAYClrrGCTGACAC．3’， 下游引物P2：5‘一GTCGGCTCGCCATTGGCTGAGAC一3’， 探针【121 1标记。 1．5病毒I讯A的提取与cDNA的合成 1369 人兽共患病一病毒病 转录。 取RNA Buffer 浴5min，立即放入冰盒，2min后依次加入5×Reaction4此，dNTP 反转录产物在70℃灭活10嘶n，即得cDNA。 1．6标准阳性模板的制备 vector进行 经209／L琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后，将回收纯化的PcR产物与克隆载体p