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在大鼠卵巢动情周期和排卵过程中的表达_临床医学论文 在大鼠卵巢动情周期和排卵过程中的表达_临床医学论文 作者：张承玉 富泽龙 郑学芝 徐秋玲 【摘要】 目的：观察松弛素样因子(RLF)基因在大鼠卵巢动情周期和排卵过程中的表达，探讨RLF在大鼠卵巢功能中的作用。方法：采用RT方法。结果：成年大鼠整个动情周期卵巢中都有RLFmRNA的表达，在动情前期、动情期卵巢表达较强 ,动情间期和动情后期卵巢较弱。PMSG处理的未成年大鼠于排卵时RLFmRNA的表达降低。结论：RLF与卵泡发育、排卵、黄体形成和退化密切相关。 【关键词】 RLF；大鼠；动情周期；排卵 作者简介：张承玉，女，讲师，硕士，从事生理学教学与生殖内分泌研究工作，Email： 松弛素样因子（relaxin）是新近发现的insulin（INSL3）基因的产物，属于胰岛素—胰岛素样生长因子—松弛素（insulin–IGF–relaxin）家族[1]。因RLF主要表达于两性生殖腺，所以已经逐渐成为生殖生理领域研究的又一热点。目前国外对RLF的研究主要集中在雄性动物，且对啮齿动物研究较少，国内鲜有RLF的实验性报道。本实验旨在观察RLFmRNA在大鼠动情周期和外源性激素诱导的模型大鼠排卵过程中表达的动态变化，以探讨RLF在大鼠卵巢功能中的作用。 1 材料与方法 1.1 实验动物以及主要试剂：健康雌性Wistar大鼠由哈尔滨医科大学第二临床医学院实验动物中心提供，自然光照，水食任取。孕马血清（PMSG）（天津实验动物中心产品），注射用绒促性素（hCG）（宁波市激素制品厂产品），Trizol RNA提取试剂（GIBCOL BRL产品），引物（上海捷倍思公司产品），TakaRa逆转录试剂盒、Tag酶、dNTP、PCR buffer、Marker（宝生物工程有限公司产品）。 1.2动情周期以及排卵：健康成年雌性Wistar大鼠250±10 g，经阴道涂片确定动情周期：动情前期，动情期，动情后期，动情间期，每一时期取材3只，断头处死大鼠，取卵巢，经197℃速冻，放入冻存管于-70℃保存，用于总RNA提取。排卵：25日龄健康雌性Wistar大鼠（60g～70g），颈部皮下注射PMSG50IU/只，促进卵泡发育，PMSG48 h后，颈部皮下注射hCG25IU/只，分别于hCG0h、4h、8h、12h、24h、48h取卵巢，每组取材3只，处理同前。 1.3 RT 1.3.1RNA的提取以及逆转录：参照文献方法[2]，应用GIBCO BRL公司Trizol RNA提取试剂，分别提取样品的总RNA。通过紫外分光光度仪测定提取的RNA样品在波长260nm和280nm处的吸光度(A)，使二者的比值(A260/A280)保持在1.80～1.985之间，符合蛋白污染容许容量(1.8～2.0)，根据A值计算出总RNA浓度。用TaKaRa的逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA；扩增的引物序列：RLF：CAACGACATCTCCTGCAC/TTGACACACACCACCTGAG；GAPDH：TCCACCACCCTGTTGCTGTA/ACCACAGTCCATGCCATCAC。 1.3.2PCR以及结果分析：总反应体系均为20ul；PCR反应的条件：RLF：94℃4min；94 ℃ 30 s；59.5 ℃30 s；72 ℃30 s 38个循环72 ℃5 min。GAPDH做内参照[3]。PCR扩增产物用含溴化乙锭（EB）的1.5%琼脂糖凝胶（1(TAE）电泳检测。凝胶图像分析系统扫描各电泳带的灰度值，计算RLF与GAPDH的灰度值的比值，即为样品RLFmRNA的表达水平。 2 结果 2.1 动情周期大鼠卵巢RLFmRNA的表达 RT结果显示：在整个动情周期大鼠卵巢都有RLFmRNA的表达，且呈周期性变化：于动情前期和动情期表达增强；动情后期和动情间期表达减弱（图1）。 2.2 大鼠卵巢RLFmRNA的表达与排卵的关系 RT结果显示：hCG刺激0 h、4 h、8 h时，大鼠卵巢RLFmRNA水平逐渐增高，呈时间依从性；而hCG刺激12 h时大鼠卵巢RLFmRNA水平降低；hCG刺激24 h、48 h时，大鼠卵巢RLFmRNA表达又开始增强（图2）。 3 讨论 卵巢是个复杂的内分泌器官，卵泡的发育、成熟、排卵、黄体的形成、退化，不仅受下丘脑—垂体—卵巢轴的调节，也和卵巢内一些局部调控因子的调节有关。RLF是新近发现的主要由性腺产生的调控因子，其在哺乳动物生殖中的作用越来越受到关注。 在雄性，RLF主要是由睾丸 Leydig细胞表达， 在其它组织图2 用RT方法检测RLFmRNA在假孕大鼠卵巢中表达的相对强度 如附睾，前列腺，丘脑下部也有RLF的转录。在雌性，RLF显示有更广泛的分布。卵巢