地塞米松诱导3T3L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立_临床医学论文.docVIP

地塞米松诱导3T3脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立_临床医学论文 地塞米松诱导3T3脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立_临床医学论文 【摘要】 目的应用地塞米松诱导3T3脂肪细胞，探讨建立方便可靠的胰岛素抵抗（IR）细胞模型的方法。方法3T3前脂肪细胞经1甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素诱导分化成3T3脂肪细胞,将其与10 nmol/L和100 nmol/L、1 μmol/L地塞米松共孵育，100 nmol/L胰岛素作用30 min刺激脂肪细胞糖转运。以葡萄糖氧化酶法测定培养液中残余的葡萄糖含量，观察地塞米松对脂肪细胞糖摄取的影响，鉴定IR模型。结果地塞米松抑制胰岛素诱导前后的脂肪细胞糖转运，抑制作用呈剂量依赖性，其中1 μmol/L地塞米松的抑制率分别为80%及75%(0.05)。结论地塞米松可诱导3T3脂肪细胞产生IR，这种细胞模型简便、可靠。 【关键词】 地塞米松 胰岛素抗药性 胰岛素 3T3细胞 胰岛素抵抗（IR）是2型糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化等疾病的共同发病基础，研究IR发生机制成为当今的重要课题。糖皮质激素是重要的胰岛素拮抗激素，临床上的过量应用会导致糖耐量异常甚至糖尿病的发生，动物试验中常用于建立糖尿病模型[1]。笔者以3T3脂肪细胞为研究对象，将糖皮质激素的长效类似物地塞米松与3T3脂肪细胞共孵育，观察处理前后3T3脂肪细胞对胰岛素短时诱导的葡萄糖摄取量的变化，探讨利用地塞米松建立3T3脂肪细胞IR模型的可行性。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1细胞3T3前脂肪细胞株由上海内分泌代谢病临床医学中心惠赠。 1.1.2试剂DMEM培养基、胰蛋白酶（美国Gibco公司）。胎牛血清（美国PAA公司）。胰岛素（丹麦诺和诺德公司）。地塞米松（D4902）、1甲基异丁基黄嘌呤（1美国Sigma公司)。葡萄糖检测试剂盒（瑞士Roche公司)。 1.1.3仪器二氧化碳培养箱（MCO，日本Sanyo公司）。生化检测仪（CX7，美国Beckman公司）。 1.2方法 1.2.13T3前脂肪细胞的培养和诱导分化3T3前脂肪细胞以含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素的DMEM培养液，在37 ℃、体积分数为0.07的CO2的条件下培养，隔天换液1次。细胞融合达80%～90%时，以0.25%胰蛋白酶消化、传代接种至24孔培养板上。细胞融合后，加含0.5 mmol/L 1甲基异丁基黄嘌呤、1 μmol/L地塞米松和10 μg/mL胰岛素的DMEM培养液培养48 h[3]；再以含10 μg/mL胰岛素的DMEM培养液培养48 h，随后以DMEM培养液继续培养6 d，诱导分化10 d左右的3T3细胞90%呈脂肪细胞表型，细胞内可见明显脂滴。 1.2.2油红O染色法鉴定脂肪细胞以10%多聚甲醛固定细胞10 min,PBS洗去后晾干。加油红O染液10 min后弃去，以异丙醇洗细胞2次，用苏木精染细胞核2 min。水洗5～10 min，倒置显微镜下观察结果，拍摄照片。 1.2.3分组将3T3脂肪细胞分为基础（非诱导）组和胰岛素诱导组（诱导组），每组再分为对照组、10 nmol/L，100 nmol/L和1 μmol/L地塞米松组。细胞同步化12 h，每孔加入含地塞米松的培养液，终浓度分别为10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L；对照组加入等体积培养液。温育48 h后诱导组中4个实验组均加入100 nmol/L胰岛素继续温育30 min。 1.2.4测定3T3脂肪细胞糖转运取细胞上清液。用葡萄糖氧化酶法测定上清液的葡萄糖含量，以未接种细胞空白复孔的糖含量均值相减，得出各孔细胞的葡萄糖消耗量。 1.3统计学处理数据以x±s表示,用SPSS 11.0软件进行统计学处理。各组间的比较采用单因素方差分析，对照组与不同浓度地塞米松组之间的比较采用Duncan法。将药物浓度值进行对数转换，采用直线回归分析药物浓度和抑制作用的关系。2结果A：3T3前脂肪细胞；B：3T3脂肪细胞；C：鉴定3T3脂肪细胞（油红O染色）. 图13T3前脂肪细胞的诱导分化及鉴定（×200） Fig 1Identification of 3T3前脂肪细胞的诱导分化及鉴定经1甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素诱导分化10 d后，细胞变圆、变亮，细胞质中大量圆形脂肪滴聚集，称为3T3脂肪细胞。以油红O染色鉴定3T3脂肪细胞，可见细胞质内脂肪滴被染成红色，细胞核呈蓝色（图1）。 2.2地塞米松对3T3脂肪细胞糖转运的影响 2.2.1非诱导组100 nmol/L、1 μmol/L地塞米松处理48 h后，葡萄糖转运量较之对照组均有明显下降（P＜0.05），提示地塞米松抑制3T3脂肪细胞的基础状态糖转运（表1），这种抑制作用呈