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基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术分析三七和海兔神经连索内的皂甙组分_临床医学论文 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术分析三七和海兔神经连索内的皂甙组分_临床医学论文 作者：冯丽剑 黄琳 卓慧钦 黄河清 【摘要】 基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI）质谱技术能高效解吸三七提取液（Panaxnotoginseng Extraction, PNE）中的混合皂甙分子为皂甙离子，并供质量分析器检测与分析。选用MALDI质谱技术直接分析色谱纯皂甙样品的纯度，其检测灵敏度优于反相高效液相色谱法（RP）。优化提取中药三七(Panax notoginseng, PN)的混合皂甙, 选用MALDI质谱技术直接分析PNE中的皂甙种类和相对含量，发现PNE至少含有20种不同分子结构的皂甙组分，其中人参皂甙(Ginsenoside) Rg1和三七皂甙（Notoginsenoside）R1含量相对较高。选用薄板层析法（TLC）制备PNE中的R1皂甙。MALDI质谱技术研究蓝斑背肛海兔(Notarcus leachiicirrosus Stimpson, NLCS)神经连索内的超微量R1的组成与分布。建立PNE皂甙的指纹图谱，并适合于评价中药三七的品质和分析体内超微量皂甙的代谢过程与机理。 【关键词】 三七，皂甙，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，指纹图谱 　　1 引言 　　人参(Ginsenoside)和三七(Panax notoginseng)是常用的名贵中药材之一，主要用于治疗各种出血瘀血之症以及跌打损伤，瘀滞肿痛，具有止血不留瘀和增强免疫力等独特功效[1,2]。皂甙是三七药材中的重要活性成分，由人参皂甙Rb1， Rg1， Re和三七皂甙R1组成[2]。近年来, PNS在神经系统疾病治疗方面和药理学研究已引起重视。三七皂甙（Panax notoginseng saponins, PNS）不仅具有增强记忆功能[3]，而且还是治疗许多神经退行性疾病相关的神经元死亡和记忆衰退等有效阻断剂[4]。有关PNS的药理尚不清楚，仅有少量的研究报道[3，5]，推测与目前尚未建立高效、高灵敏度且能连续监测的皂甙成分的分析技术有关。 　　目前，已从三七的不同部位中分离出二十几种皂甙，其中多数皂甙与人参皂甙的成分相同，即为达玛烷型的20(S)原人参二醇型[20 (S) protopanaxadiol]，如：Rb1， Rb2， Rc， Rd等组分；20(S)原人参三醇型[20 (S)，如：Re， Rf， Rg1， Rg1， Rh1等组分，其中Rg1和Rb1含量最高[6，7]。除人参皂甙组分以外，PNS也含有三七皂甙，如: R1， R2， R4， R6， Fa， Fc， Fe等组分[8,9]，其中R1的含量相对较高。有关皂甙R1的药效和药理学的研究也甚少。 　　采用柱层析法、高效液相色谱蒸发光散射法[10]、薄层层析法、液滴逆流层析法、气相色谱、高效液相色谱[11]和液质联用技术[12]，分离与鉴定色谱纯的人参和三七皂甙的分子结构与组成已见报道，但对制备质谱纯的皂甙单体且用于药物疗效的研究甚少，从而限制了深入研究皂甙药理学和皂甙免疫增强机理。 　　MALDI质谱分析技术具有快速、简单、高灵敏度和高分辨率等特点，但用于直接分析皂甙分子结构与组成的研究报道也甚少。本研究采用MALDI质谱技术直接分析PNE和海兔神经连索内的皂甙组成和相对含量，本方法适合评价三七的药材品质、皂甙药效和体内代谢途径与机理。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　REFLEX Ⅲ 型MALDI质谱仪（德国Bruker公司）； 1100型高效色谱仪（美国Agilent公司）；GENESYSZ型紫外可见分光光度计（美国Water公司）； LABCONCO Fezone 18冻干机（美国Labconco公司）。 　　三氟乙酸（TFA）和乙腈(HPLC级，德国Merck公司)； 胰蛋白酶（V5111，Promega公司); 基质； α氰羟肉桂酸（HCCA，美国ICN生物医学公司）。 　　2.2 标准人参皂甙和三七皂甙提取与分离 　　用超纯水分别配制0.1 g/L人参皂甙Rg1， Rb1， Re标准溶液。 以0.1 mg三七皂甙R1混合溶液，作为标准品。取三七粉末0.6 g，加入乙醇50 mL，放置过夜，置80 ℃水浴上保持微沸至乙醇挥发干净，再加入50 mL超纯水溶解样品。按照文献[1,５]的HPLC方法分离与鉴定三七提取液中的皂甙成分与含量，制备色谱纯的皂甙单体。以乙腈为流动相A，以水为流动相B，在0～12 min，以0～19% A进行梯度分离；在12～60 min，以19%～36% A进行梯度分离。检测波长为203 nm。 　　2.3 薄层层析分离板制备