外源性FHIT基因转染对人胃癌细胞系MKN45迁移和侵袭能力的影响_临床医学论文.docVIP

外源性FHIT基因转染对人胃癌细胞系MKN迁移和侵袭能力的影响_临床医学论文 外源性FHIT基因转染对人胃癌细胞系MKN迁移和侵袭能力的影响_临床医学论文 作者：刘飞，黄培林，黄照权，李楠，徐佳佳，吴鹏 【摘要】 目的： 探讨脆性组氨酸三联体(FHIT)基因转染对人胃癌细胞MKN迁移和侵袭能力的影响。方法： 将载有人外源性FHIT基因的真核表达质粒pcDNA3.1，转染至FHIT mRNA阴性表达的人胃癌细胞MKN，分别应用Millicell小室细胞迁移实验、Transwell小室侵袭实验检测转染前后MKN细胞迁移能力和侵袭力的改变。结果： 外源性FHIT基因转染MKN细胞后， MKN细胞的迁移能力明显降低(0.05)，但细胞侵袭能力无明显变化(Pgt;0.05)。结论： 外源性FHIT基因转染致MKN细胞系的迁移能力明显降低，对MKN细胞系的侵袭能力无明显影响。 【关键词】 脆性组氨酸三联体;胃癌;基因转染;迁移;侵袭 我国属胃癌高发国家，其发病率与死亡率均居全身恶性肿瘤前列，近年发病率有增高趋势。因此，探讨胃癌发生、发展的分子机制，做到早期预防、早期诊断和早期治疗，寻找新的治疗靶点以及有效的治疗方式成为目前研究的热点。脆性组氨酸三联体( fragile histidine triad, FHIT)基因是Ohta等于1996年从上皮癌细胞系3p14.2区域克隆出的一个候选抑癌基因，在多种肿瘤组织和细胞系中发现FHIT基因有结构及表达异常的报道[1。作者用外源性FHIT基因转染FHIT阴性表达的MKN细胞，观察其对胃癌细胞迁移、侵袭的影响，为深入研究FHIT基因在胃癌的发生、发展中的作用机制提供新线索。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　人低分化胃腺癌细胞MKN由东南大学临床医学院中心实验室馈赠;小鼠成纤维细胞系NIH3T3由东南大学基础医学院病理学与病理生理学系实验室馈赠;培养MKN细胞用含10%的新生小牛血清、100IU·L-1青霉素和100IU·L-1链霉素的RPMI1640培养液，置于5%CO2、37℃、湿饱和培养箱培养;细胞小室购自美国Millipore公司;RPMI1640培养基购自美国Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;脂质体Lipofectamin2000购自美国Invitrogen公司;其它生化试剂均为分析纯。 　　1.2 方法 　　1.2.1 真核表达质粒pcDNA3.1的转染 参照说明书，用Lipofectamine2000将真核表达质粒pcDNA3.1转染至FHIT基因mRNA阴性表达的人胃癌细胞MKN。转染后采用G418筛选阳性克隆，并且继续培养。用RT法检测FHIT mRNA的表达。 　　1.2.2 Millicell小室细胞迁移实验检测细胞迁移能力变化 (1) 趋化因子的制备：用含10%小牛血清的高糖DMEM培养液,培养NIH3T3细胞至饱和度达80%时弃去原培养液，加入不含血清的RPMI1640培养液3～4ml，培养24　h后收集培养液，2 000 r·min-1离心5～10min，取上清液过滤后-70℃冻存备用。利用饥饿培养的NIH3T3细胞分泌至上清液中的一系列趋化因子，趋化肿瘤细胞向下室运动。 (2) 分别收集空白对照组(MKN、pcDNA3.1空质粒转染组(pcDNA3.1和pcDNA3.1转染组(pcDNA3.1细胞各1×105个，用含1%FBS的RPMI1640洗涤细胞3次;将小室置入6孔板，在小室内加入1×105个细胞，在6孔板内加入1 600 μl趋化液;常规培养8 h后取出小室。用95%酒精固定细胞，然后行HE染色。轻轻用棉签擦净小室上室面无侵袭性的细胞，在倒置显微镜下放大200倍计数移至微孔膜下层的细胞数目，每个样本随机选择10个视野计数后取均值。实验重复3次。 　　1.2.3 Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力变化 (1) 趋化因子的制备同迁移实验。(2) 侵袭小室的制备：细胞小室为一杯状结构，杯底由聚碳酸脂膜构成，膜孔径8 μm。将人工合成的基底膜材料Matrigel胶用同样体积的无血清培养液稀释后，分别取300 μg均匀加于每个小室的膜上，十字摇晃使胶平铺在聚碳酸脂膜上。37 ℃成胶30 min。使用前加无血清培养液于小室内37℃放置20 min，使Matrigel胶重新水化。(3) 接种细胞：细胞分组同迁移实验，将细胞小室放入6孔培养板中，在小室外加入1 500 μl含趋化因子的条件培养液，在小室内加入800 μl细胞悬液(含1×105个细胞)，常规培养24～72 h，分别在24、48、72 h观察。(4) 取出Transwell小室，弃去上室中的培养液，用生理盐水棉签轻擦去Matrigel胶，在倒置显微镜下观察侵袭细胞数。95%乙醇固定