外源性碱性成纤维细胞生长因子对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响_临床医学论文.docVIP

外源性碱性成纤维细胞生长因子对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响_临床医学论文 外源性碱性成纤维细胞生长因子对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响_临床医学论文 【摘要】 目的 研究外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响。方法 将40只大鼠随机分为4组：正常对照组、长期大量吸烟组、短期大量吸烟组、吸烟+bFGF组（吸烟最后15 d经腹腔内注射bFGF）。采用线栓大脑中动脉法建立大鼠脑梗死模型。采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL法）及免疫组化法检测细胞凋亡和p53蛋白表达。结果 各吸烟组脑细胞凋亡及p53蛋白表达较对照组明显增加(P＜0.01)，凋亡细胞数量和p53蛋白表强度随吸烟时间和剂量增加而增加(P＜0.01)。bFGF治疗组大鼠脑细胞凋亡数及p53蛋白表达较单纯吸烟组明显减少(P＜0.01)。结论 吸烟可使大鼠脑细胞凋亡及p53蛋白表达增加，p53介导吸烟诱导的细胞凋亡，细胞凋亡及p53蛋白表达强度与吸烟时间及数量相关，bFGF 通过抑制p53表达减少细胞凋亡。 【关键词】 外源性碱性成纤维细胞生长因子；吸烟；凋亡；p53； 脑细胞凋亡与缺血性脑损伤密切相关。近年来研究发现，吸烟或烟雾暴露可诱导脑细胞发生凋亡，。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是很有临床应用价值的一种神经营养因子，其神经活性广泛，能保护神经元，促进神经生长，具有抗缺血性脑损伤的作用。目前国内外尚无关于外源性bFGF对吸烟所致脑细胞凋亡影响的报道。本实验将外源性bFGF应用于吸烟大鼠，通过对大鼠脑细胞凋亡及p53蛋白表达进行比较，探讨外源性bFGF对吸烟所致脑细胞凋亡的作用及其机制，为临床应用bFGF提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物吸烟模型的建立及分组 健康成年雄性Wister大鼠40只（由中国医科大学实验动物中心提供），体重200～250 g，随机平均分成4组：（1）正常对照组；（2）长期大量吸烟组：燃烧香烟10支×2次/d，共90 d ；（3）短期大量吸烟组：燃烧香烟10支×2次/d，共45 d；（3）长期大量吸烟+bFGF组：吸烟量及时间与（2）组相同，于吸烟最后15 d腹腔内注射bFGF。各吸烟组均用尼古丁含量为1.5 mg/支的市售某品牌香烟，置于80 cm×60 cm×40 cm大小的自制烟熏箱中，实验期间各组大鼠饲养条件一致。 　　1.2 标本制备 各组大鼠用10%水合氯醛麻醉后，开胸经心腔快速灌注肝素化生理盐水250 ml，用4%多聚甲醛磷酸缓冲液（4℃，0.1 mol/L PBS配置，pH7.4），灌注固定30 min。断头取脑，置于4℃相同浓度的多聚甲醛缓冲液中固定过夜，常规石蜡包埋，连续冠状切片，片厚约5 μm。相邻切片分别行TUNEL及免疫组化染色。 　　1.3 TUNEL法检测细胞凋亡 凋亡检测试剂盒购自武汉博士德生物试剂公司。切片依次经二甲苯脱蜡，剃度酒精水化，蛋白酶K 20 μg/ml 37℃消化15 min，TBS（pH7.4）洗5 min，3次。滴加TUNEL反应液（TdT 1 μl，DIG，18 μl标记缓冲液，20 μl/片），37℃孵育2 h。TBS洗2 min，3次;加生牡素化地高辛抗体，37℃孵育30 min，TBS洗2 min，3次;DAB显色，苏木素复染。TBS洗。树胶封片。阴性对照TUNEL反应液中去掉了TdT酶，其余操作同上。 　　1.4 免疫组化染色 p53多克隆抗体购自武汉博士德生物试剂公司。切片常规脱蜡入水。0.3%过氧化氢37℃作用10 min灭活内源性酶。0.01 mol/L柠檬酸缓冲液（pH 6.0）高压修复2 min左右，冷却至室温，滴加5%BSA封闭液37℃，20 min。加p53抗体，4℃过夜。PBS洗5 min，3次;加生物素化羊抗兔IgG 37℃孵育 20 min，PBS洗2 min，3次。滴加SABC 37℃，20 min。PBS洗3 min，5次。DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照用PBS代替一抗，其余操作同上。 　　1.5 图像分析与数据处理 用显微成像系统采集图片，计算并分析阳性细胞平均灰度值，数据用SPSS10.0软件进行单因素方差分析，各组间比较用两样本均数比较的t检验。 　　2 结果 　　2.1 大鼠脑细胞凋亡 见表1。镜下凋亡细胞TUNEL阳性染色为褐色圆形或椭圆形实心小体。正常对照组偶有散在的凋亡细胞。各吸烟组与正常对照组相比，凋亡细胞明显增多（P＜0.01）。长期大量吸烟组凋亡细胞较短期大量吸烟组明显增多（P＜0.01）。bFGF治疗组凋亡细胞较两单纯吸烟组明显减少，但仍较正常对照组明显增多（P＜0.01）。凋亡细胞分布以海马区最