大鼠CD36基因真核表达载体的构建及表达_临床医学论文.docVIP

大鼠CD36基因真核表达载体的构建及表达_临床医学论文 大鼠CD36基因真核表达载体的构建及表达_临床医学论文 【摘要】 　　目的: 构建大鼠CD36真核表达载体, 并在293T细胞中表达。方法: 应用RT技术, 从大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞提取的总RNA中, 获得CD36基因编码序列片段, 克隆至真核表达载体pEGFP中, 对重组质粒进行酶切和测序鉴定后, 以脂质体介导法转染至293T细胞, 通过荧光显微镜和Western blot检测其在293T细胞中的表达。结果: 酶切和测序证明重组真核表达载体pEGFP构建成功, 荧光显微镜及Western blot确认目的基因序列在293T细胞中过表达。结论: 成功构建大鼠CD36基因的重组真核表达载体pEGFP并在293T细胞中过表达。 【关键词】 CD36; 真核表达载体; 293T细胞; 表达 　　CD36是一种相对分子质量（Mr）为88 000的细胞表面单链糖蛋白, 属于B 类清道夫受体, 在体内血小板、 内皮细胞以及巨噬细胞等多种细胞表面表达, 因其能与多种配体结合而具有复杂的生物学功能［1］。CD36是血小板反应素（trombospondin TSP1）的受体, 通过与TSP在细胞表面发生特异性结合参与转化生长因子（transforming growth factor）的活化、 介导TSP抗血管生成作用, 在纤维化、 抗血管生成、 肿瘤免疫等方面有重要作用［1］。国内外研究表明, CD36与TSP特异性结合是TGF活化过程中的关键环节, 而TGF又与肺纤维化的发生发展密切相关［2, 3］。在本实验中, 我们克隆了大鼠CD36基因, 并构建其真核表达载体, 为进一步研究其功能奠定基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 质粒pEGFP购自Clontech公司, 大肠杆菌DH5α购自Amersham biosciences公司, 293T细胞购自中科院细胞库, NR8383细胞购自ATCC细胞库。TRIzol试剂、 Lipofectamine2000购自Invitrogen公司; RT购自promega公司; Taq DNA聚合酶和蛋白质Marker标准均购自大连宝生物工程有限公司 (TaKaRa公司); 限制性内切酶Xho Ⅰ、 Kpn Ⅰ、 T4 DNA连接酶购自NEB公司; DNA Marker标准购自上海捷瑞生物工程有限公司; 质粒抽提试剂盒购自QIAGEN公司; 凝胶纯化回收试剂盒购自北京天根科技生化有限公司; 羊抗大鼠CD36抗体和兔抗羊二抗购自Santa公司; ECL化学发光试剂盒购自Amersham biosciences公司; 其余一般化学试剂均为国产分析纯。 　　1.2 方法 　　1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank的大鼠CD36基因的序列（序列号为: NM_031561）设计合成引物, 引物序列为: 上游引物: 5′GGCTGCGATCGGAAC3′, 下游引物: 5′引物5′端分别加入XhoⅠ和KpnⅠ酶切位点(框线内部分)。引物由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。 　　1.2.2 总RNA提取及RT扩增 采用TRIzol一步法依照说明书提取NR8383细胞中的总RNA。取2 μg的RNA用M反转录酶反转录成cDNA, 以此为模板, 进行PCR扩增CD36基因。反应体系: 10×buffer 2 μL, 2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL, 引物各0.4 μL, 5 U/μL Taq酶0.2 μL, ddH2O 15.2 μL, 模板1 μL, 计20 μL反应体系。扩增条件: 94℃ 30 s变性, 94℃ 30 s变性, 55℃ 30 s退火, 72℃ 1.5 min延伸; 循环30次; 最后72℃延伸6 min。PCR扩增产物电泳后, 回收目的片段。 　　1.2.3 pEGFP重组质粒的构建与鉴定 用XhoⅠ、 KpnⅠ分别酶切pEGFP和CD36基因片段, DNA凝胶回收试剂盒回收酶切片段。将回收片段按目的基因和载体浓度为1∶1, 反应体系10 μL, 在T4连接酶作用下4℃连接12 h, 转化DH5α感受态菌。经卡那霉素筛选, 挑取阳性克隆菌落, 摇菌提取质粒, 进行XhoⅠ、 KpnⅠ双酶切鉴定, 酶切鉴定正确的克隆送上海吉凯基因化学技术有限公司进行DNA测序, 将完全正确的质粒命名为pEGFP。 　　1.2.4 pEGFP重组质粒转染293T细胞 293T细胞用含有100 mL/L胎牛血清的DMEM培养, 转染前24 h传代, 接种入24孔板中, 每孔2×105个细胞, 待每孔细胞密度达到70%～80%时按Lipofectamine2000操作说明书进行质粒转染。培养48 h后, 荧光显微镜下观察绿色荧