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大肠杆菌Mn-SOD基因的克隆及表达_临床医学论文 大肠杆菌Mn-SOD基因的克隆及表达_临床医学论文 作者：李佩珍，张洪勤，应俊，李东 【摘要】 目的:实现Mn-SOD基因在大肠杆菌（E.coli）中的可溶性表达，并对表达产物进行活性测定。方法：用PCR方法从大肠杆菌2号基因组中扩增Mn-SOD基因编码区，克隆到pUCm-T Vector，测定核苷酸序列；再将基因编码区克隆到原核表达载体PET-28a，构建含Mn-SOD基因的重组表达质粒，转化到大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达。结果 ：SDS分析表明SOD的表达量约为细菌总蛋白的50%；黄嘌呤氧化酶法测定表达蛋白活性，菌体可溶性总蛋白中表达产物酶比活为3921.8 U/mg，是对照BL21的276.8倍。结论：Mn-SOD基因可在BL21中成功表达，产物具有高可溶性、高活性的特点。 【关键词】 大肠杆菌；Mn-SOD；原核表达；活性测定 Abstract: Objective: To achieve the soluble expression of Mn-SOD gene in E.coli and assay the enzyme activity of the expressed product. Methods: The coding region of superoxide dismutase was amplified using PCR method from the E.coli genome. The PCR product was cloned into PUC19-T vector and sequenced.In addition，the cloned coding region of Mn-SOD was inserted into the expression vector PET-28a to form the recombinant plasmid PET-28a-Mn-SOD and was then transformed into E.coli BL21 for expression. Results: The SDSanalysis revealed that the expression recombinant SOD accumulated up to 50% of the total bacterial protein. The enzyme activity of Mn-SOD was assayed with xanthine oxidase method. The result showed that the specific activity of the expressed product in the total soluble protein was 3921.77 U/mg，and was 276.77 times of.E.coli BL21. Conclusion ：Mn-SOD gene can be success fully expressed in E.coli products hate the chardcteristics of high solubihity ard high activity. Key words: E.coli；Mn-SOD；prokaryotic expression；enzyme activity 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是细胞体内歧化超氧阴离子自由基(O-2)的一个抗氧化酶，按其结合的金属性离子根据其中金属辅基的不同可分为4类：Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD和Ni-SOD，它们通过催化超氧阴离子自由基0-2发生歧化反应，达到清除O-2的效果，具有防御氧毒性、增强机体抗辐射损伤能力、防衰老以及治疗某些肿瘤、炎症、自身免疫疾病等功效，广受国内外科研工作者的关注和重视[1]。通过转SOD基因技术实现SOD的大规模发酵生产，具有良好的应用前景。本研究运用分子生物学技术对大肠杆菌Mn-SOD基因的全长编码序列进行克隆，采用原核表达技术对其进行原核表达，应用SOD酶活测定进行表达产物的酶活鉴定，成功地实现了Mn-SOD基因的克隆和表达，为该基因的下一步研究和应用打下了良好的基础。 1 材料和方法 1.1 质粒及菌种 E.coli JM109、E.coli BL21、PET-28a为本实验室保存；PUCm-T载体购自上海生工生物工程技术服务有限公司。 1.2 试剂 各种限制性内切酶，T4DNA Ligase、RNAase、溶菌酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司，100 bp Marker购自北京晶美生