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大肠杆菌sRNA的研究进展_临床医学论文 大肠杆菌sRNA的研究进展_临床医学论文 作者：王晨红 李春更 李洪涛 【关键词】 大肠杆菌;RNA/未翻译;研究方法 sRNAs即small RNAs或非编码RNAs(noncoding RNAs)是一类长度在几十至几百个核苷酸之间，执行多种功能的非编码RNA[1]。sRNA分子最初是在细菌体内发现的，现已知广泛存在于从原核生物的细菌到高等的哺乳动物等多种不同的生物体内，主要对基因表达起调控作用。本文主要以原核生物大肠杆菌为例，就其sRNA的发现、功能、可能的作用机制及探求新sRNA的方法和Hbq蛋白在sRNA执行功能时的作用作一综述。 　　1 sRNA的发现 　　1967年，通过对大肠杆菌体内所有的RNA进行标记，在聚丙烯酰胺凝胶上探测到一种数量较多的新RNA分子，从而使大肠杆菌的第一个sRNA被发现，随后又相继发现了11个sRNA，其中RprA，MicF，DicF，和DsrA是作为基因片段被发现的;GcvB和OxyS是探查基因时偶然发现的，而Spot42，10Sa(tmRNA)和10Sb等是通过磷酸化标记所有的RNA后被发现的(现在被称为M1，是RNA酶P的RNA元件)[3。但是他们的生理功能直到30年后才被阐明。原核生物的sRNA长度一般在50～250nt之间，长于真核生物中成熟的miRNA，它们在细胞中通常不被翻译，而是作为重要的调控因子参与原核生物基因的转录和翻译调控及其RNA的稳定、成熟和加工等多个过程。 　　2 识别sRNA的方法 　　由于sRNA通过实验性探查或传统序列分析的方法很难检测到，因此尽管我们已知这些RNA分子对生物体的生理功能具有重要作用，但实际上许多的sRNA分子都是在研究个别基因系统时被偶然发现的[8]。近年来随着systematic computational，microarray和cloning新技术的应用，新的sRNA分子不断被发现，至今在大肠杆菌体内已发现了超过百余种的sRNA分子[9]。 　　2.1 systematic computational法 　　大肠杆菌完整基因序列的获得，使得通过系统搜寻在其基因序列中寻找sRNA的编码基因成为可能[10]。由于sRNA不翻译且仅依据二级结构就将非编码的RNA分子从随机序列中分离出来不够精确，因此采用computational法识别sRNA时要参考一些已知的sRNA基因序列特征。通过对已知sRNA分子编码基因序列分析发现，sRNA分子的基因位点主要存在于称为“empty”的基因间区，此位点没有其他 　　的注释基因。此外sRNA分子的基因序列与有亲缘关系的其他菌属间具有高度的保守性。通过这些特征可以将在终止子上游的短序列中寻找启动子序列作为重点[11]。在“empty”基因间区，通过Colibri database限定注释基因。在基因间区寻找大肠杆菌广泛使用的转录起始和转录终止信号，且这些信号也被已知的sRNA采用的。然后将重点放在能被大肠杆菌主要RNA聚合酶的σ亚基识别的启动子序列上，在这些序列上选择启动子和终止子间50～400个碱基对的序列，选用与其他菌属细菌基因序列高度保守的序列作为预测的被选序列。通过这种方法在大肠杆菌中产生了24个假设的sRNA的基因，其中两个通过运算被证明是编码sRNA的基因，即rprA和gcvB。 　　2.2 microarray法 　　通过序列探查识别sRNA仍存在困难，因此根据sRNA在有亲缘关系的菌属中高度保守的特性及对转录本的大量分析，采用高密度的寡核苷酸探针微阵来探求位于大肠杆菌基因间区的sRNA的基因。通过这种方法在大肠杆菌体内证明了23个新的RNA分子的存在并通过Northern分析所证实。在这23个基因中有6个推测可能为短的开放读码框，而17个可能是新的功能性的sRNA分子[12]。 　　2.3 RNomic(shotgun cloning)法 　　虽然sRNA包含了大肠杆菌转录本的最重要的部分，但毕竟不是RNA的全部。因为通过试验探查RNA时其实验环境已被限定，而且它稳定的二级结构可能在寡核苷酸微阵探查时已遭到破坏或发生了改变。此外，虽然大多数通过探查得到的sRNA分子是由独立的基因编码的，但是一些sRNA也可通过长的转录本的加工而产生，如大肠杆菌的6sRNA[13]。 　　与依赖于预测的方法不同，RNA的cDNA克隆主要识别那些在给定条件下由一定基因组表达的数目为50～500个核苷酸的RNA分子，而与其是否为独立编码或是否由加工产生无关。这个方法已成功地用于在一些真核生物和古细菌中寻找新的sRNA，此方法包括cDNA文库的构建、生物信息学分析、RNA分离、Northern探查、RNA半衰期的测定及5′和3′末端的快速扩增。 　　3 sRNA的功能和作