大肠埃希菌O157-H7检测方法探讨_临床医学论文.docVIP

大肠埃希菌O157-H7检测方法探讨_临床医学论文 大肠埃希菌O157:H7检测方法探讨_临床医学论文 【摘要】 目的 对大肠埃希菌O157:H7的检测方法进行探讨，减轻日常工作量，节约成本，提高阳性检出率。方法 将PCR技术和免疫磁珠法相结合，样品先进行PCR检测，阳性的样品再以免疫磁珠法进行分离和鉴定。结果 从245件猪粪、牛粪样品中应用免疫磁珠和PCR结合方法，阳性检出率为8.98%，高于直接应用免疫磁珠法的阳性检出率6.12%。结论 此方法为大肠埃希菌O157:H7的检测提供了一个新的思路，节约了人力和物力，提高了工作效率和阳性检出率。 【关键词】 免疫磁珠法；大肠埃希菌O157:H7；PCR技术 Study on method for detecting E.coli O157:H7 【Abstract】 Objective To discuss the detection method for E.coli O157:H7.We can economize cost，release the work，enhance the positive rate.Methods Combined the polymerase chain reaction technique with immunomagnetic sand method，we could detect these samples with PCR at first，and then collected and detected the positive species by using immunomagnetic sand method.Results We have detected 245 species of dung by using this operational procedure.The result proved that the positive rate can be up to 8.98% above the rate of 6.12% by using immunomagnetic sand method only.Conclusion It is a new idea for us to release the work and enhance the positive rate by using this operational procedure for detect the E.coli O157:H7. 【Key words】 immunomagnetic sand method; E.coli O157:H7; polymerase chain reaction 自从1982年在美国发生了首次由大肠埃希菌O157:H7引起出血性肠炎暴发以来，该菌在世界范围内曾有过多次食源性暴发。1996年在日本发生的人类历史上规模最大的一次暴发，引起了全世界的关注［1］。目前大肠埃希菌O157:H7 感染呈全球流行，已被认定是20世纪70年代以来新发现的8种传染病病原体之一［2］。我国亦加强了大肠埃希菌O157:H7的监测。为了提高阳性检出率，减轻工作量，本课题对大肠埃希菌O157:H7的检测方法进行了探讨和研究。 1 材料与方法 1.1 样品来源 2004年5～10月采集奉贤区各个畜牧场猪粪、牛粪样品，共计245件。 1.2 仪器与试剂 1.2.1 PCR扩增仪 Techne Flexigene。 1.2.2 大肠埃希菌O157PCR引物 上游引物：5’ AGGGCTATTGGTTCGTTCCT 3’，下游引物：5’ AGGCCTGAAAGTCGTAGCAA 3’，其扩增产物片段长度为519bp。上述引物及相关试剂由上海宝生科技发展有限公司合成提供。 1.2.3 全自动数码凝胶成像系统 Tanon GIS-2010。 1.2.4 免疫磁珠试剂、混匀器 (Dynabeads anti-E.coli O157;Dynal Sample Mixer)。 1.2.5 培养基及诊断血清 MEC增菌液及各类糖发酵生化试剂均由上海市疾病预防控制中心提供。Chromagar O157显色平板由上海博塞科技发展有限公司提供。大肠埃希菌O157及H7诊断血清由成都生物制品研究所提供，均在有效期内使用。 1.3 方法 1.3.1 PCR检测法 1.3.1.1 样品的前处理 将样品棉签置于MEC增菌液9ml中，42℃增菌18h后，以5合1的混合方式，将增菌液混合。2500rpm离心10min。取上清液500μl，12000rpm离心5min，弃上清液，加100μl DNA提取